寧亞萍,董施彬,李建霞,楊　喆,張喬會,董潔瓊,王建中

(林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,生物科學與技術學院,北京林業(yè)大學，北京 100083)

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山杏花總黃酮抗氧化活性及其對酪氨酸酶抑制作用的研究

寧亞萍,董施彬,李建霞,楊喆,張喬會,董潔瓊,王建中*

(林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,生物科學與技術學院,北京林業(yè)大學，北京 100083)

利用閃式提取法提取山杏花總黃酮,并以X-5大孔樹脂進行分離。通過測定分離前后山杏花總黃酮對DPPH自由基、羥基自由基的清除能力,總還原能力和總抗氧化能力,評價了其抗氧化活性;通過測定酪氨酸酶催化L-多巴氧化速率,以VC和β-熊果苷為陽性對照,研究了分離前后山杏花總黃酮對體外酪氨酸酶活性的抑制作用。結(jié)果表明,分離前后山杏花總黃酮均具有一定的抗氧化活性,且分離后抗氧化活性得到明顯提高;分離前后山杏花總黃酮對酪氨酸酶的抑制能力均強于β-熊果苷弱于VC,其IC50值分別為2.24、3.08 mg/mL。綜上所述,分離前后山杏花總黃酮均具有一定的抗氧化活性,且能有效抑制酪氨酸酶的活性。

山杏花總黃酮,抗氧化活性,酪氨酸酶,抑制作用

山杏又稱西伯利亞杏(Siberianapricot),薔薇科杏屬植物。山杏在我國分布范圍較廣,作為山杏附屬資源的山杏花,資源豐富[1]。但是,目前由于對山杏花的開發(fā)利用研究較少,造成了山杏花資源的極大浪費。

自由基可引起機體衰老,與人體的一些重大疾病例如癌癥等有一定的相關性[2-3]。天然植物中的提取物例如茶多酚、黃酮類物質(zhì)具有良好的抗氧化性,與傳統(tǒng)的化學合成的抗氧化劑相比,安全性更高[4],因此具有良好的開發(fā)前景。酪氨酸酶在黑色素的合成過程中起著關鍵性的作用,酪氨酸酶抑制劑可以通過抑制酪氨酸酶活性預防和治療黑色素瘤、色素沉著等,在醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)等領域有著廣闊的應用前景[5-6]。劉杰超等[7]以L-酪氨酸和L-多巴作為酶促反應底物研究了桃花甲醇提取物對酪氨酸酶的抑制作用,研究表明桃花甲醇提取物中總黃酮含量為92.28 mg/g,提取物對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性IC50分別為0.057,0.030 g/L。任紅榮等[8]以L-酪氨酸為底物測定了香水蓮花水提物、醇提物及總黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制率,結(jié)果表明總黃酮提取物抑制作用最強。

本文旨在研究山杏花總黃酮的抗氧化活性以及對酪氨酸酶活性的抑制作用,為山杏花在保健食品、醫(yī)藥、化妝品領域的開發(fā)利用提供理論基礎,為山杏花資源的開發(fā)拓寬思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山杏花(采于內(nèi)蒙古包頭);1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl,DPPH),Alfa Aesar公司;羥自由基測定試劑盒南京建成生物工程研究所;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)北京科百奧生物技術有限公司;酪氨酸酶(25 ku),Worthington公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過硫酸鉀、無水乙醇,均為分析純北京科百奧生物技術有限公司;X-5大孔樹脂北京科百奧生物技術有限公司;L-多巴,熊果苷,抗壞血酸北京科百奧生物技術有限公司;蘆丁標準品國藥集團化學試劑有限公司。

JHBE-50S 閃式提取控制器北京金鼐科技發(fā)展有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵上海振捷實驗設備有限公司;SCIENTZ-12N 冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司;FA2004電子天平上海上平儀器有限公司;紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申順生物科技有限公司;pHSJ-3F pH計上海瀘西分析儀器。

1.2實驗方法

1.2.1山杏花的脫脂預處理將山杏花置于30 ℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重,經(jīng)粉碎機粉碎后60目過篩,用石油醚進行索氏抽提,除去其中的油脂和部分色素,自然晾干,于4 ℃冰箱中密封保存,備用。

1.2.2山杏花總黃酮粗提物的制備運用閃式提取器按照液料比100∶1 mL/g,乙醇體積分數(shù)76%,閃提溫度67 ℃,閃提時間5 min的工藝條件對經(jīng)預處理的山杏花進行提取得到粗提液,過濾,旋蒸濃縮至水相,冷凍干燥得到山杏花總黃酮粗提物。

1.2.3山杏花總黃酮粗提物的分離利用X-5大孔樹脂分離1.2.2得到的粗提物,工藝條件為上樣流速1 mL/min、pH2、質(zhì)量濃度0.7 mg/mL的樣品水溶液上樣,5 BV水洗和5 BV的95%乙醇溶液以2 mL/min洗脫。洗脫液經(jīng)旋蒸濃縮至水相,冷凍干燥得到經(jīng)分離后的粉末狀供試樣品,簡稱為山杏花總黃酮提取物。

1.2.4黃酮含量的測定參考文獻[9],以蘆丁為標準品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定并計算粗提物及經(jīng)分離后提取物中總黃酮的含量。

1.2.5山杏花總黃酮清除DPPH自由基的測定稱取5.0 mg粗提物、總黃酮提取物、VC和蘆丁,分別用70%乙醇定容至25 mL容量瓶中,配制成0.2 mg/mL的母液,然后用70%乙醇稀釋成10、20、30、40、60、80 μg/mL的測定液。

參考崔潔等的方法[10],每個樣品重復測定3次,取平均值。

1.2.6山杏花總黃酮清除羥基自由基(·OH)的測定稱取50.0 mg粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用蒸餾水定容至25 mL容量瓶中,配制成2.0 mg/mL的母液,再用蒸餾水稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的測定液。

測定方法:按照羥自由基測定試劑盒說明書操作,在550 nm波長處測定各管吸光度。以VC作為對照。加入測定液體積為0.2 mL。每個樣品重復測定3次,取平均值。

1.2.7山杏花總黃酮總還原力的測定稱取12.5 mg粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用蒸餾水定容至25 mL容量瓶中,配制成0.5 mg/mL的母液,再用蒸餾水稀釋成20、60、100、140、180、220 μg/mL的測定液。分別取1 mL不同濃度的測定液于10 mL離心管中,加入2 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液(0. 2 mol/L,pH6. 6)和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴20 min,加入2 mL10%三氯乙酸溶液,混勻,迅速冷卻。然后取2 mL上述混合液于10 mL離心管中,加入2 mL蒸餾水和0. 4 mL 0. 1%的三氯化鐵溶液,混勻,在700 nm處測定其吸光度(A700)。以A700表示測定樣品的還原能力,以蒸餾水為空白,每個樣品重復測定3次,取平均值[11-12]。吸光度越高,說明還原力越強,則抗氧化性越強[13]。

1.2.8ABTS法測定山杏花總黃酮總抗氧化能力稱取12.5 mg粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用70%乙醇定容至25 mL容量瓶中,配制成0.5 mg/mL的母液,再用70%乙醇稀釋成所需濃度梯度的測定液。

ABTS工作液的配制:稱取0.0384 g ABTS,蒸餾水定容到10 mL容量瓶;稱取0.0331 g過硫酸鉀,蒸餾水定容到50 mL容量瓶;取適量上述兩種溶液等體積混合,避光放置14 h;取混合液(混合液現(xiàn)配現(xiàn)用),加無水乙醇稀釋至其在734 nm處測得的吸光度為0.70±0.02即可使用。

測定方法:取1.0 mL不同濃度的測定液于10 mL離心管中,加4.0 mL ABTS工作液,充分振蕩,室溫靜置6 min,在734 nm測量吸光度。以無水乙醇作為空白,以VC作陽性對照,每個樣品重復測定3次,取平均值[14-15]。公式如下:

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A0為空白樣的吸光度;A1為測定樣的吸光度。

1.2.9山杏花總黃酮對酪氨酸酶的抑制作用酪氨酸酶活力以催化L-多巴氧化反應生成多巴醌的二酚酶活力來衡量,以β-熊果苷和VC作陽性對照。稱取100.0 mg的粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中,配制成10.0 mg/mL的母液,再用蒸餾水稀釋成所需濃度梯度的測定液。β-熊果苷用無水乙醇溶解配制成10.0 mg/mL的母液,用蒸餾水稀釋成所需濃度梯度。L-多巴和酪氨酸酶均用磷酸鹽(PBS)緩沖液(0. 2 mol/L,pH6. 8)溶解,分別配制成1.0 mg/mL和186 U/mL。按照表1進行操作:

表1　實驗操作表Table 1　Experimental operation table

30 ℃水浴10 min后,加入0.2 mL酪氨酸酶溶液,靜置反應1 min,迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中在475 nm處測吸光度值[16-17]。計算公式如下:

式中,A1、A2、A3、A4分別為實驗組1、2、3、4反應體系的吸光度。

1.2.10IC50的計算IC50是指清除率為50%時所需的樣品濃度。根據(jù)實驗計算得到的清除率,運用SPSS17.0軟件處理,計算樣品的半數(shù)清除濃度(IC50)。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel2007和SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1粗提物與分離后得到的總黃酮提取物中的總黃酮含量

蘆丁標準品的質(zhì)量濃度(c,mg/mL)與吸光值(A)的回歸方程為A=11.929c-0.0059(R2=0.9992)。

根據(jù)測定及計算結(jié)果可知,1g粗提物中總黃酮含量為0.29g(RSD=1.26%),1g經(jīng)分離后得到的總黃酮提取物中總黃酮含量為0.93g(RSD=1.92%)。

2.2山杏花總黃酮抗氧化結(jié)果分析

2.2.1對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基,其乙醇溶液在517nm處有強烈吸收。自由基清除劑能提供一個電子與DPPH的孤對電子配對使其褪色,褪色程度與其接受的電子呈定量關系[18]。

由圖1可知,分離前后山杏花總黃酮均有一定的清除DPPH自由基的能力。分離前后山杏花總黃酮清除DPPH·的能力均隨質(zhì)量濃度的增大而增強,且在10～60μg/mL的范圍內(nèi)具有一定的線性關系。當質(zhì)量濃度為60μg/mL時,純化后的山杏花總黃酮對DPPH·的清除率已達到90.18%。分離后的山杏花總黃酮在質(zhì)量濃度大于60μg/mL時,對DPPH·的清除能力與VC相接近。分離前后山杏花總黃酮清除DPPH自由基的IC50值分別為71.35、22.10μg/mL,VC的IC50值為10.09μg/mL?？芍?jīng)過分離,山杏花總黃酮清除DPPH自由基的能力得到了明顯提高,其具有較強的清除DPPH·的能力。

圖1　分離前后山杏花總黃酮清除DPPH自由基的能力Fig.1　The scavenging effect of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers on DPPH·

2.2.2對羥基自由基(·OH)的清除能力測定結(jié)果從圖2可以看出,在0.2～1.2 mg/mL的范圍內(nèi),VC、分離前后的山杏花總黃酮對·OH的清除率隨質(zhì)量濃度的增大不斷增大,在0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)上升較快。在0.6～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的增大,分離前后山杏花總黃酮對·OH的清除率之間的差異逐漸減小。當質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時,分離前后山杏總黃酮的清除率分別達到80.88%、85.66%,其清除·OH的IC50值分別為0.48、0.27 mg/mL,VC的IC50值為0.24 mg/mL。說明分離前后山杏花總黃酮都具有較強的清除·OH的能力,且分離后的山杏花總黃酮的清除能力得到了很大提高,且IC50值與VC相近,但兩者均弱于VC。

圖2　分離前后山杏花總黃酮清除羥基自由基的能力Fig.2　The scavenging effect of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers on·OH

2.2.3總還原力測定結(jié)果由圖3可知,各質(zhì)量濃度分離前后的山杏花總黃酮、VC均具有一定的還原能力,其還原能力與質(zhì)量濃度在20～220 μg/mL范圍內(nèi)均具有一定的線性相關性。隨著質(zhì)量濃度的增大,三者的還原能力均不斷增大,且分離后山杏花總黃酮的還原能力始終優(yōu)于純化前,但弱于VC。

圖3　分離前后山杏花總黃酮的總還原能力Fig.3　Total reduction capacity of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers

2.2.4總抗氧化能力測定結(jié)果ABTS經(jīng)活性氧氧化可生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·,當存在自由基清除劑時,會與ABTS+·發(fā)生反應而使反應體系褪色。ABTS+·在734 nm處有最大吸收,可檢測其吸光度的變化[19]。

從圖4可以看出,在10～50 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),分離前后山杏花總黃酮的質(zhì)量濃度與對ABTS+·的清除率有明顯的量效關系。隨著質(zhì)量濃度的增加,清除率均呈上升趨勢,但分離前的山杏花總黃酮清除ABTS+·始終弱于純化后的。VC清除ABTS+·極強,當質(zhì)量濃度為20 μg/mL時,清除率已達99.24%。當質(zhì)量濃度為50 μg/mL時,分離后的山杏花總黃酮對ABTS+·的清除率為95.48%,與VC相當,說明分離后的山杏花總黃酮對ABTS+·的清除能力也是很強的。從圖4可知,分離后山杏花總黃酮及VC的IC50值分別為20.61、5.99 μg/mL。

圖4　分離前后山杏花總黃酮的總抗氧化能力Fig.4　Total antioxidant capacity of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers

2.3對酪氨酸酶活性抑制能力的測定結(jié)果

從圖5c可以看出,在1.0～6.0 mg/mL范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增大,分離前后山杏花總黃酮對酪氨酸酶活性的抑制能力均逐漸增大。當質(zhì)量濃度小于3.0 mg/mL時,分離前的山杏花總黃酮對酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于分離后,其原因可能是在低質(zhì)量濃度下分離前的粗提物里還含有多糖等物質(zhì),某些多糖與黃酮類物質(zhì)在協(xié)同作用下抑制酪氨酸酶的能力更強。當質(zhì)量濃度大于4.0 mg/mL時,分離后的山杏花總黃酮的抑制效果優(yōu)于分離前,其原因可能是隨著濃度的增大,相比于分離前,分離后山杏花總黃酮中具有較強抑制酪氨酸酶能力的某些黃酮類物質(zhì)的濃度相對增大。

圖5　四種物質(zhì)對酪氨酸酶活性的抑制能力Fig.5　The inhibitory effect of four substances on tyrosinase activity注：a:VC;b:β-熊果苷；c:分離前后山杏花總黃酮。

由圖5根據(jù)計算得出四種物質(zhì)的IC50值如表2所示,可知分離后的山杏花總黃酮的IC50值是β-熊果苷的10.3%,是VC的40.5倍。說明分離前后山杏花總黃酮均有較強的抑制酪氨酸酶活性的能力。

表2　四種物質(zhì)抑制酪氨酸酶的IC50值Table 2　The concentration of four substances required to inhibit tyrosinase activity by 50%

3　結(jié)論

分離前后的山杏花總黃酮均具有一定的抗氧化活性,且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨濃度的增大活性逐漸增強。經(jīng)X-5大孔樹脂分離后,山杏花總黃酮的抗氧化活性得到了明顯提高,但分離前后山杏花總黃酮的抗氧化活性均低于天然類的抗氧化劑VC;分離前后的山杏花總黃酮對酪氨酸酶活性均具有一定的抑制能力,在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增大,抑制率逐漸升高,其IC50值分別為2.24、3.08 mg/mL,且抑制能力強于β-熊果苷弱于VC。

鑒于山杏花總黃酮具有較好的體外抗氧化活性以及對酪氨酸酶的抑制能力,今后可以對其進一步分離純化、進行結(jié)構鑒定以及體內(nèi)動物實驗,為山杏花在醫(yī)藥、化妝品、保健食品等領域的開發(fā)利用提供更多的科學依據(jù)與理論指導。

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Antioxidant activity and inhibitory activity on Tyrosinase of total flavonoids fromSiberianApricotflowers

NING Ya-ping,DONG Shi-bin,LI Jian-xia,YANG Zhe,ZHANG Qiao-hui,DONG Jie-qiong,WANG Jian-zhong*

(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Total flavonoids fromSiberianapricotflowers were extracted with the method of flash extraction and purified with X-5 macroporous resins.The antioxidant activity of separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers were investigated by measuring scavenging effect on DPPH·and OH·,total reduction capacity,total antioxidant capacity and the inhibitory effect on tyrosinase activity was studied by measuring the rate of tyrosinase catalyzedL-DOPA oxidation taking VCandβ-arbutin as positive controls. The results showed that separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers had a certain antioxidant activity. After separation,the antioxidant activity was improved obviously,the inhibitory effect on tyrosinase of separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers was better thanβ-arbutin but worse than VC. Their half maximal inhibitory concentration(IC50)were 2.24,3.08 mg/mL,respectively. In conclusion,separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers had a certain antioxidant activity and can effectively inhibit tyrosinase activity.

total flavonoids fromSiberianapricotflowers;antioxidant activity;tyrosinase;inhibitory effect

2015-07-09

寧亞萍(1989-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)與利用,E-mail:nypszb@163.com。

王建中(1952-)，男，碩士，教授，研究方向：林產(chǎn)品加工利用,E-mail:w62338221@163.com。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201004081)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0104-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.012