張怡欣,何勝華,唐海珊,馬　鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

?

β-胡蘿卜素/酪蛋白納米復(fù)合物的形成及β-CE的生物利用率

張怡欣,何勝華*,唐海珊,馬鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

β-胡蘿卜素(β-CE)具有多種生物活性,但是不穩(wěn)定,容易降解,利用酪蛋白(CN)對β-胡蘿卜素進(jìn)行自組裝能夠?qū)ζ淦鸬奖Ｗo(hù)作用,從而提高β-胡蘿卜素在食品工業(yè)中的利用價值。本文以β-CE/CN形成納米復(fù)合物為背景,研究了其形成的影響因素、粒徑分布以及β-CE的生物利用率。結(jié)果表明,β-CE/CN納米復(fù)合物的形成受溫度與β-CE/CN質(zhì)量比的影響較大,β-胡蘿卜素經(jīng)酪蛋白自組裝后,其水溶解性提高。經(jīng)體外消化實驗,β-CE/CN納米復(fù)合物經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解后,酶解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,酪蛋白隨著酶解時間的延長其水解程度增加,因此β-CE從納米復(fù)合物中更易釋放出來,其生物利用率提高。

β-胡蘿卜素,酪蛋白,納米復(fù)合物,生物利用率

乳蛋白由于其價廉、無毒、高營養(yǎng)價值以及多種結(jié)構(gòu)和功能特性使得其適合各種生物活性物質(zhì)的載體[1]。酪蛋白(CN)在整個蛋白中所占比例較高,在牛乳中以膠束的形式存在。酪蛋白的自組裝作用是Semo等人首次提出,隨著人們對酪蛋白自組裝作用的認(rèn)識,利用酪蛋白自組裝作用作為生物活性物質(zhì)的載體也越來越受到人們的重視[2]。Zimet等人利用酪蛋白膠束和酪蛋白納米粒子來作為多不飽和脂肪酸的載體,大大的提高了不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性[3]。Bargarum等人利用β-CN與疏水性維生素D混合,利用β-CN的自組裝作用,形成了β-CN/維生素D納米粒子復(fù)合物,其膠束的粒徑接近于天然酪蛋白膠束,提高了維生素D在水介質(zhì)中的穩(wěn)定性,對紫外光誘導(dǎo)降解起到了顯著的保護(hù)作用[4]。

β-胡蘿卜素(β-CE)是維生素A的前體,具有多種生物活性功能[5]。國內(nèi)外大量研究表明:β-CE具有抗癌和作為天然抗氧化劑的作用,而且還可以作為天然色素應(yīng)用于飲料加工中[6]。然而,β-CE在食品工業(yè)中的應(yīng)用有較大的局限性,主要是由于β-CE對光、熱、氧等條件十分敏感,極其不穩(wěn)定,容易降解,另外,β-CE的水溶性差[7]。β-CE與CN在體外通過自組裝作用形成β-CE/CN納米復(fù)合物,對β-CE起到了保護(hù)的作用,而且CN在胃腸中易于消化吸收,因此為β-CE的釋放和提高生物利用率創(chuàng)造了條件[8]。

本研究以酪蛋白酸鈉為原料,通過β-CE與CN混合,形成β-CE/CN納米復(fù)合物,并測定影響β-CE/CN納米復(fù)合物形成的因素,β-CE/CN納米復(fù)合物的粒徑分布以及β-CE/CN納米復(fù)合物的生物利用率。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

β-胡蘿卜素SIGMA公司，酪蛋白酸鈉蒙牛乳業(yè)，丙酮天津科密歐化學(xué)試劑廠，氯化鈣天津博迪化工有限公司，磷酸氫二鉀天津博迪化工有限公司，檸檬酸三鈉天津致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司，胰蛋白酶SIGMA公司，胃蛋白酶SIGMA公司，十二烷基硫酸鈉天津博迪化工有限公司，過硫酸銨天津博迪化工有限公司，甲醇天津科密歐化學(xué)試劑廠，冰乙酸天津科密歐化學(xué)試劑廠，考馬斯亮藍(lán)南京奧多福尼生物公司。

pH計sartorius，電子天平上海越平科學(xué)儀器有限公司，HWS24型恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司，F(xiàn)-2700型熒光分光光度計HITACHI，激光粒度分析儀 Malvern公司，DYY-8C型凝膠電泳儀北京六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1β-CE/CN納米復(fù)合物的制備18 mL 0.3 mmol/L的β-胡蘿卜素丙酮溶液經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾,并與4 mL 1 mol/L檸檬酸三鈉共同加入到200 mL 5%的酪蛋白酸鈉溶液中,然后將24 mL 0.2 mol/L的K2HPO4和20 mL 0.2 mol/L的CaCl2分8次加入上述溶液中,每次間隔15 min,在加入過程中,溶液在37 ℃水浴鍋中邊攪拌邊加入,加完后將溶液pH調(diào)至6.7,最后用蒸餾水將上述溶液定容到400 mL,將pH重新調(diào)至6.7,輕輕攪拌1h,通過CN的自組裝得到β-CE/CN納米復(fù)合物[9]。

1.2.2β-CE/CN納米復(fù)合物熒光強(qiáng)度測定

1.2.2.1溫度對β-CE/CN納米復(fù)合物的影響在溫度分別為28、32、36、40、44、48 ℃,β-CE與CN質(zhì)量比為1∶300,pH6.7的情況下,按1.2.1的方法分別對β-CE進(jìn)行自組裝,使用熒光分光光度計測定相對熒光強(qiáng)度來表示自組裝分子在不同溫度環(huán)境中的最佳組裝條件,其中激發(fā)波長為301 nm,發(fā)射波長為409 nm。

1.2.2.2β-CE與CN質(zhì)量比對β-CE/CN納米復(fù)合物的影響在β-CE與CN質(zhì)量比分別為1∶200、1∶250、1∶300、1∶350、1∶400、1∶450,在溫度40 ℃,pH6.7的情況下,按1.2.1的方法分別對β-CE進(jìn)行自組裝,使用熒光分光光度計測定相對熒光強(qiáng)度來表示自組裝分子在不同溫度環(huán)境中的最佳組裝條件。

1.2.2.3pH對β-CE/CN納米復(fù)合物的影響在pH分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4,β-CE與CN質(zhì)量比為1∶300,pH6.7的情況下,分別進(jìn)行自組裝,使用熒光分光光度計測定相對熒光強(qiáng)度來表示自組裝分子在不同溫度環(huán)境中的最佳組裝條件。

1.2.4β-CE/CN納米復(fù)合物的生物利用率

1.2.4.1胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將β-CE/CN納米復(fù)合物中加入2 g胰蛋白酶,調(diào)pH至胰蛋白酶活性位點,37 ℃水浴條件下攪拌,分別在酶解0、30、60、90、120 min時取樣并分別用HCl終止反應(yīng),將5個時間段所取樣品進(jìn)行SDS-PAGE。

胰蛋白酶解產(chǎn)物采用SDS-PAGE進(jìn)行分析,分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%,酶解產(chǎn)物用上樣緩沖液稀釋后取10 μL點樣于進(jìn)樣孔,電泳槽運(yùn)行電壓穩(wěn)定在120 V,分離的蛋白用考馬斯亮蘭進(jìn)行染色1h,然后用脫色液(冰乙酸∶甲醇∶水=7.5∶7.5∶85,v∶v∶v)進(jìn)行脫色,最后經(jīng)凝膠成像處理,水解產(chǎn)物分子量的確定通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量進(jìn)行比較。

1.2.4.2胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將β-CE/CN納米復(fù)合物中加入0.5 g胃蛋白酶,調(diào)pH至胃蛋白酶活性位點,37 ℃水浴條件下攪拌,分別在酶解0、30、60、90、120 min時取樣并分別用NaOH終止反應(yīng),將5個時間段所取樣品進(jìn)行SDS-PAGE,其條件同胰蛋白酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。

2　結(jié)果與分析

2.1β-CE/CN納米復(fù)合物熒光強(qiáng)度測定結(jié)果分析

研究表明,酪蛋白與脂溶性分子β-CE相結(jié)合會使β-CE熒光基團(tuán)發(fā)生淬滅,因此利用熒光分光光度計測得的β-CE/CN納米復(fù)合物自組裝分子的相對熒光強(qiáng)度會低于正常濃度的β-CE的相對熒光強(qiáng)度。根據(jù)相對熒光強(qiáng)度的大小能夠表現(xiàn)出酪蛋白與子β-CE的結(jié)合強(qiáng)度[7]。

圖1～圖3分別為溫度、β-CE與CN質(zhì)量比與pH對β-CE/CN納米復(fù)合物影響的熒光強(qiáng)度結(jié)果圖。圖1中,當(dāng)自組裝溫度在28～40 ℃范圍內(nèi),其熒光強(qiáng)度變化不大,因此溫度在此范圍內(nèi)對β-CE/CN納米復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度影響較小,而當(dāng)溫度為44、48 ℃時,其熒光強(qiáng)度顯著增大。由此可知,溫度超過40 ℃時,β-CE/CN納米復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度顯著降低;從圖2中可以看出,當(dāng)β-CE與CN質(zhì)量比為1∶300時,其熒光強(qiáng)度最小,β-CE/CN納米復(fù)合物結(jié)合強(qiáng)度最大,當(dāng)β-CE與CN質(zhì)量比為1∶200與1∶250時,β-CE/CN納米復(fù)合物結(jié)合強(qiáng)度略低于質(zhì)量比為1∶300時的結(jié)合強(qiáng)度,但差異并不顯著,而當(dāng)β-CE與CN質(zhì)量比大于1∶300時,β-CE/CN納米復(fù)合物結(jié)合強(qiáng)度顯著降低(p<0.05),質(zhì)量比超過1∶400時結(jié)合強(qiáng)度的變化趨于穩(wěn)定;由圖3可知,pH在6.4～7.4的范圍內(nèi),β-CE/CN納米復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值基本趨于穩(wěn)定,在pH為7時其熒光強(qiáng)度稍有降低,但差異并不顯著,因此可知,pH對β-CE/CN納米復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度的影響不大。

圖1　溫度對β-CE/CN納米復(fù)合物影響的熒光強(qiáng)度Fig.1　Effect of temperature on fluorescence intensity from β-CE/CN nanoparticle complex

圖2　β-CE與CN質(zhì)量比 對β-CE/CN納米復(fù)合物影響的熒光強(qiáng)度Fig.2　Effect of ratio of β-CE to CN on fluorescence intensity from β-CE/CN nanoparticle complex

圖3　pH對β-CE/CN納米復(fù)合物影響的熒光強(qiáng)度Fig.3　Effect of pH on fluorescence intensity from β-CE/CN nanoparticle complex

2.2β-CE/CN納米復(fù)合物粒徑測定結(jié)果分析

圖4是β-CE/CN納米復(fù)合物及對照組的粒徑分布情況,由圖4可以看出,β-CE/CN納米復(fù)合物的平均粒徑為18.53 nm,酪蛋白酸鈉的平均直徑為47.63 nm，經(jīng)自組裝的β-CE/CN納米復(fù)合物的平均粒徑與對照組酪蛋白的平均粒徑相比顯著減小。該結(jié)果說明β-CE經(jīng)酪蛋白自組裝以后,酪蛋白與β-CE結(jié)合以后,其β-CE能更好的分散于水溶液中,提高了其水溶解度。

圖4　β-CE/CN納米復(fù)合物與對照組酪蛋白粒徑分布Fig.4　Particle size distribution of β-CE/CN nanoparticle complex and casein

2.3β-CE/CN納米復(fù)合物中β-CE的生物利用率

圖5　胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解β-CE/CN 納米復(fù)合物產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.5　SDS-PAGE of enzymatic hydrolysis product from β-CE/CN nanoparticle complex by trypsin and pepsin

為了分析β-CE/CN納米復(fù)合物中β-CE的生物利用率,本實驗通過體外模擬腸道中胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解β-CE/CN納米復(fù)合物,以酪蛋白的降解來分析β-CE的釋放。

圖5A為胰蛋白酶酶解β-CE/CN納米復(fù)合物產(chǎn)物的SDS-PAGE圖,從該圖可以看出,隨著酶解時間的延長,分子量范圍為25.0～35.0 ku的酪蛋白在SDS-PAGE中條帶的密度逐漸降低,說明了酪蛋白的降解增大,說明了β-CE從β-CE/CN納米復(fù)合物中釋放率增加。

圖5B為胃蛋白酶酶解β-CE/CN納米復(fù)合物產(chǎn)物的SDS-PAGE圖,從該圖可以看出,胃蛋白酶解以后,其酪蛋白條帶幾乎消失,而在酪蛋白條帶的下面,出現(xiàn)了很多條帶,說明了酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶解以后,產(chǎn)物中出現(xiàn)了更多的小分子量蛋白和肽。隨著胃蛋白酶酶解時間的延長,小分子量蛋白的密度降低,說明產(chǎn)物中有更多的小分子量蛋白和肽,隨著蛋白的不斷酶解,β-CE也會逐漸釋放出來。

3　結(jié)論

在特定的條件下,β-胡蘿卜素與酪蛋白能夠形成β-CE/CN納米復(fù)合物,實驗中分別測定了不同溫度、β-CE與CN質(zhì)量比、pH對β-CE/CN納米復(fù)合物形成的影響,溫度高于40 ℃與β-CE與CN質(zhì)量比大于1∶300時不利于β-CE/CN納米復(fù)合物的形成,而pH對β-CE/CN納米復(fù)合物的形成沒有顯著的影響。β-CE/CN納米復(fù)合物的平均粒徑小于酪蛋白,說明β-CE經(jīng)酪蛋白自組裝后,提高了β-CE的水溶性。體外模擬胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解作用的結(jié)果顯示,隨著酶解時間的延長,酪蛋白被酶解的量增加,表明β-CE從β-CE/CN納米復(fù)合物中會更多的釋放出來,提高了β-CE的生物利用率。

[1]Yoav D. Milk protein as vehicles for bioactives[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2010,15:73-83.

[2]Semo E,Kesselman E,Danino D，et al. Casein micelle as a natural nano-capsular vehicle for nutraceuticals[J]. Food Hydrocolloids,2007,21:936-942.

[3]Zimet P,Rosenberg D,Livney Y D. Re-assembled casein micelles and casein nanoparticles as nano-vehicles for u-3 polyunsaturated fatty acids[J]. Food Hydrocolloid,2011,25:1270-1276.

[4]Bargarum J,Danino D,Livney Y D. Nanoencapsulation of vitamin D in beta casein micelles. Aposter presentation at the IFT 2009 Annual Meeting Anaheim,CA,USA,June 2009.

[5]Maria J,Saiz A,Carolina G F,et al. Thermal protein ofβ-carotene in re-assembled casein micelles during different processing technologie applied in food industry. 2013:138,1581-1587.

[6]Yi J,Li Y,Zhong F,et al. The physicochemical stability andinvitrobioaccessibility of beta-carotene in oil-in-water sodium caseinate emulsions[J]. Food Hydrocolloids,2014,35:19-27.

[7]Martin A,Mattea F,Gutierrez L,et al. Co-precipitation of carotenoids and bio-polymers with the supercritical anti-solvent process[J]. Journal of Supercritical Fluids,2007,41:138-147.

[8]Avi S,Yifat C,Yoav D. Thermally-inducedβ-lactoglobulin-EGCG nanovehicles:Loading,stability,sensory and digestive-release study[J]. Food Hydrocolloids,2012,29:57-67.

[9]Maria S,Carolina G F,Ana M R,et al. Thermal protection ofβ-carotene in re-assembled casein micelles during different processing technologies applied in food industry[J]. Food Chemistry,2013,138:1581-1587.

[10]Thiebaud M,Dumay E,Picart L,et al,Cheftel J C. High-pressure homogenisation of raw bovine milk. Effects on fat globule size distribution and microbial inactivation[J]. International Dairy Journal,2003(13):427-439.

[11]孔小宇,劉寧.β-乳球蛋白-番茄紅素自組裝分子抗消化性的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33(3)：60-67.

Formation ofβ-CE/CN nanoparticle complex and bioavailability ofβ-CE

ZHANG Yi-xin,HE Sheng-hua*,TANG Hai-shan,MA Ying

(College of Food Science & Engineering,Harbin Institute of Technology of China,Harbin 150090,China)

β-carotene(β-CE)has various biological activities,but it is unstable and easily degradation.β-carotene self-assembles in casein(CN)and form nanoparticle complex,with plays an important role in protectingβ-carotene. Thereby,β-carotene/CN nanoparticle complex can enhances the utilization value ofβ-carotene in the food industry. The paper was based on the formation ofβ-CE/CN nanoparticle complex,and the influence factors,such as formation,the particle size distribution and bioavailability ofβ-CE were investigated. The results showed that temperature andβ-CE/CN mass ratio had great impact on its formation,β-CE re-assembled in CN can improve water solubility ofβ-CE. After digestion experimentinvitro,β-CE was hydrolyzed by trypsin and pepsin,the hydrolysis degree of casein was increased with the increase of hydrolysis time. Therefore,β-CE easily released fromβ-CE/CN nanoparticle complex and its bioavailability was enhanced.

β-carotene;casein;nanoparticle complex;bioavailability

2015-05-19

張怡欣(1991-),女,碩士研究生,研究方向:乳品化學(xué)與乳品加工技術(shù),E-mail:zyxkysmile@163.com。

何勝華(1974-)，男,博士,講師,研究方向:乳品化學(xué)與乳品加工技術(shù),E-mail:heshenghua@hit.edu.cn。

中國博士后特別資助(2014T70360)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)05-0068-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.005