董凱鋒,安　娜,李東樂,鄧漢森,車建途,*

(1.北京威力格生物科技有限公司,北京 102200;2.山西水塔醋業(yè)股份有限公司,山西太原 030404)

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水塔老陳醋大曲酵母的分離鑒定及產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯特性

董凱鋒1,2,安娜1,2,李東樂1,2,鄧漢森1,車建途1,2,*

(1.北京威力格生物科技有限公司,北京 102200;2.山西水塔醋業(yè)股份有限公司,山西太原 030404)

采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法,從水塔老陳醋大曲中分離純化出21株酵母菌,利用26S rDNA D1/D2序列分析方法結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,對(duì)分離純化的酵母菌進(jìn)行鑒定,并用其發(fā)酵糯米糖化液,用靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用的方法測定發(fā)酵后乙醇和乙酸乙酯的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):21株酵母菌鑒定結(jié)果為2株弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii),8株扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、6株異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、3株葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、2株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)。21株菌株發(fā)酵后產(chǎn)物乙醇和乙酸乙酯的含量存在較大差別,其中產(chǎn)生乙酸乙酯和乙醇最多的菌株分別為異常威克漢姆酵母m12(含量為4.4415 g/L)和扣囊復(fù)膜酵母q25(含量為48.577 g/L);產(chǎn)生最少的則分別為扣囊復(fù)膜酵母q6(含量為0.0037 g/L)和東方伊薩酵母q12(含量為11.4555 g/L)。提示老陳醋大曲中不同種類的酵母菌在發(fā)酵中對(duì)乙醇和乙酸乙酯具有不同的貢獻(xiàn)。

老陳醋大曲,酵母菌,靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用,乙醇,乙酸乙酯

山西老陳醋歷史悠久,風(fēng)味獨(dú)特,是我國的四大名醋之一。老陳醋釀造過程中大曲起到了關(guān)鍵作用。大曲是經(jīng)過長期馴化,多種微生物彼此共存、順序生長和代謝互補(bǔ)的微生物群體[1]。從大曲中篩選優(yōu)勢功能菌株,再將其應(yīng)用于改善大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)是優(yōu)化老陳醋大曲的重要措施之一。山西老陳醋相關(guān)的微生物研究多集中于產(chǎn)酸功能菌、紅曲霉、高糖化酶菌株,未見用分子生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)方法結(jié)合研究大曲中酵母菌的報(bào)道[2-5]。酵母菌是老陳醋釀造過程中產(chǎn)酒和生香的關(guān)鍵功能菌,直接影響釀酒過程,進(jìn)而影響老陳醋的出品率和風(fēng)味[1]。本實(shí)驗(yàn)從山西水塔老陳醋大曲(簡稱大曲)中篩選出21株酵母菌,通過對(duì)其26S rDNA D1/D2測序進(jìn)行菌株鑒定并分別發(fā)酵糯米糖化液,采用靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法分析各菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇和產(chǎn)乙酸乙酯的含量,確定各菌株的發(fā)酵產(chǎn)乙醇和產(chǎn)乙酸乙酯的能力。為進(jìn)一步優(yōu)化老陳醋大曲提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料和方法

1.1材料和儀器

大曲由水塔醋業(yè)股份有限公司提供;酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;糯米購自市場;α-高溫淀粉酶、糖化酶購自四川省山野生物科技有限公司;氯化鈉分析純,購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;Dream Taq Green PCR Master Mix購自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR購自寶生物工程有限公司;富集培養(yǎng)基酵母粉1%,葡萄糖2%,蛋白胨2%,調(diào)pH至4.5培養(yǎng)基滅菌后再加入鏈霉素(終濃度30 μg/mL)、青霉素(終濃度為50 μg/mL),孟加拉紅0.033 mg/mL;YPD固體培養(yǎng)基2%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂粉;YPD液體培養(yǎng)基2%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖。

電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;DK-450B型電熱恒溫水槽上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HWS智能型恒溫恒濕箱寧波江南儀器廠;HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱太倉市豪誠實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;分光光度計(jì)、BK-FL2熒光顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司;GeneAmp PCR System 2720(ABI)賽默飛世而科技(中國)有限公司;ChampGel凝膠成像分析系統(tǒng)北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)美國安捷倫科技有限公司;HSS 86.50型全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器意大利DANI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母菌的分離純化將10 g曲粉加入100 mL無菌蒸餾水中,振蕩(28 ℃,200 r/min)20 min。取菌懸液3 mL接種于富集培養(yǎng)基中,振蕩(28 ℃,200 r/min)培養(yǎng)48 h,從中取出菌液1 mL加入9 mL無菌蒸餾水,配制成10-2菌懸液,再依次配制10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液,取0.1 mL涂布于YPD固體平板上,28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h,挑選典型酵母單菌落,傳代4次后,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酵母菌形態(tài)學(xué)觀察將酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基平板中,28 ℃下培養(yǎng)3 d,觀察平板中菌落的形態(tài),并挑起菌體制片,在顯微鏡下觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3酵母菌基因組DNA的制備按說明書(Instruction of Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)方法分別制備21株酵母菌基因組DNA作為26S D1/D2擴(kuò)增模板。

1.2.4PCR擴(kuò)增rDNA 26S D1/D2正向引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′),反向引物NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。反應(yīng)體系(50 μL)為:模版5 μL(50 μg),引物各2 μL(20 pmol/μL),Taq DNA聚合酶Mix 25 μL,去離子水16 μL。

擴(kuò)增程序:95 ℃變性5 min;95 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。將rDNA測序結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/,通過BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5種子液制備將保存的菌種劃線轉(zhuǎn)接YPD固體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)2～3 d,重復(fù)劃線和培養(yǎng)三次以活化菌種。菌種活化后轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)(28 ℃,200 r/min)1 d,得到種子液。

1.2.6糯米糖化液的制備和接種發(fā)酵預(yù)煮:稱取糯米1000 g,加水(料水比1∶3.4)攪拌均勻后75 ℃水浴1 h。

糊化:加750 μL耐高溫α-淀粉酶(酶活20000 U/mL),攪拌均勻,95 ℃保溫2 h。

糖化:待滅菌鍋?zhàn)匀唤禍刂?0 ℃以下,取出糊化液冷卻至62 ℃,加入糖化酶2 mL(酶活100000 U/mL),62 ℃保溫1 h。

酒精發(fā)酵:按照每100 mL發(fā)酵液加入1 mL種子液。30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后封口發(fā)酵7 d,得到酒精發(fā)酵液。

1.2.7酒精發(fā)酵液中乙醇和乙酸乙酯含量測定樣品前處理:精確取2.00 mL酒精發(fā)酵液上層液體,置于20 mL頂空瓶中,密封壓蓋;

頂空條件:加熱爐、取樣系統(tǒng)和傳輸管操作溫度分別為20、85、110 ℃;樣品在爐內(nèi)加熱時(shí)間為20 min。選擇其中2個(gè)樣品做重復(fù)性測試。

氣相條件:色譜柱為HP-INNOWAX(60.0 m×250 μm,0.25 μm);色譜柱初始溫度40 ℃(保持3 min),以5 ℃/min的速度升至80 ℃,繼之以10 ℃/min升至200 ℃(保持5 min);氣化室和傳輸線溫度分別為250 ℃和220 ℃;載氣He;載氣流量1.0 mL/min;分流進(jìn)樣(分流比100∶1)。

質(zhì)譜條件:EI源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿150 ℃;掃描模式Scan;掃描質(zhì)量范圍為30～500 u。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用外標(biāo)法對(duì)乙醇和乙酸乙酯進(jìn)行定量。首先根據(jù)樣品中乙醇和乙酸乙酯峰面積的大致響應(yīng)范圍,分別配制兩種物質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后按照樣品測試的實(shí)驗(yàn)條件,測試各標(biāo)準(zhǔn)溶液中二者的峰面積,最后利用最小二乘法計(jì)算乙醇和乙酸乙酯的線性回歸方程,結(jié)果如下:

乙醇低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液范圍:0～9.53 g/L,回歸方程:y=5606951.2x+791724.4,R2=0.998;高濃度標(biāo)液范圍:9.53～296.87 g/L,回歸方程:y=2588367.9x+59013372.0,R2=0.992。

表1　26S D1/D2測序比對(duì)分析

乙酸乙酯低濃度標(biāo)液范圍:0～0.75 g/L,回歸方程:y=101653279.3x-172461.2,R2=0.9997;高濃度標(biāo)液范圍:0.75～13.11 g/L,回歸方程:y=72043695.8x+21651150.8,R2=0.9999。

2　結(jié)果與討論

2.1酵母菌菌落和細(xì)胞形態(tài)特征

從大曲中分離得到21株優(yōu)勢酵母菌。依據(jù)酵母形態(tài)學(xué)特征,將菌株進(jìn)行初步分類,選取其中10株具有代表性的菌株描述其菌落和細(xì)胞形態(tài)(圖1)。

圖1　酵母菌的菌落形態(tài)(Lane1,Lane3)和光學(xué)顯微鏡下的菌體形態(tài)(Lane2,Lane4,400×)Fig.1　Colony morphological phenotypes of yeasts isolated from DAQU(Lane1,Lane3)and the cellular morphology under light microscope(Lane2,Lane4,400×)

菌落m10、q28、m12、q13、m25、q34表面濕潤光滑,有光澤,凸起,邊緣整齊;m17和q10表面干燥,褶皺,邊緣為裂片狀,隆起;q7和q12表面濕潤,無光澤,邊緣絲狀延伸,隆起。細(xì)胞以出芽方式生殖,m10和q28為圓形,m12、q13、m17和q10為橢圓形,m25和q34既有橢圓形又有圓形,q7和q12為梭形。

2.2酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析

從大曲中分離的21株優(yōu)勢酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析結(jié)果見表1。

由表1測序結(jié)果可知,21株酵母的鑒定結(jié)果為2株弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii)分別為m10、q28,8株扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)分別為q6、q33、q25、m11、m26、q10、q14、m17,6株異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)分別為q3、q13、q27、q19、m15、m12,3株葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)分別為m25、q2、q34,2株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)分別為q7、q12。q3等菌種在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)結(jié)果與異常威克漢姆酵母、異常畢赤酵母相似度均為99%,最新酵母分類學(xué)將部分異常威克漢姆酵母、異常畢赤酵母、異常漢遜酵母三種酵母歸為同物異名[6]。老陳醋大曲中微生物的分離鑒定多采用生理生化結(jié)合形態(tài)觀察的方法[7-8],而本研究對(duì)分離菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2測序分析,使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確[9]。

2.3乙醇和乙酸乙酯含量

21株酵母酒精發(fā)酵液中乙醇及乙酸乙酯生成量如圖2所示。

圖2　靜態(tài)頂空-氣質(zhì)法測得酒精發(fā)酵液中乙醇和乙酸乙酯含量Fig.2　The content of ethyl acetate and ethyl acetate in the fermented solution after fermentation with each of the yeasts using static headspace-GC-MS

圖2顯示,21株酵母均能利用糯米糖化液發(fā)酵產(chǎn)生乙醇,同種類酵母菌比較,多數(shù)菌株產(chǎn)生乙醇量較為接近,但某些種類菌株產(chǎn)生的乙醇量變化范圍比較大。如異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)產(chǎn)生的乙醇量最高(q19)為46.2845 g/L,最低(m12)為22.5805 g/L,相差一倍多。不同種類酵母菌之間比較,葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)m25、q2、q34發(fā)酵產(chǎn)乙醇相對(duì)較多,東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)q12、q7則相對(duì)較少,差別最大(q34與q12之間)能達(dá)到三倍以上;不同種類酵母菌產(chǎn)生乙酸乙酯差異明顯,依次為:異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)m12、m15、q13、q19、q27、q3>弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii)m10、q28>葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)m25、q2、q34>東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)q12、q7>扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)m11、m17、m26、q6、q10、q14、q25、q33。異常威克漢姆酵母菌(Wickerhamomycesanomalus)m12產(chǎn)乙酸乙酯最多,含量為4.4415 g/L,扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)q25產(chǎn)乙醇最多,含量為48.577 g/L。產(chǎn)生最少的則分別為扣囊復(fù)膜酵母q6(含量為0.0037 g/L)和東方伊薩酵母q12(含量為11.4555 g/L)。

從自然界中富集酵母產(chǎn)乙酸乙酯和乙醇的研究已有很多報(bào)道,如靳艷玲等[10]利用釀酒酵母發(fā)酵甘蔗產(chǎn)生乙醇量達(dá)到132.26 g/L;朱浩里等[11]以早秈稻糖化液為原料,用釀酒酵母發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)乙醇得率為0.463 g/g;李銳利[12]從釀造用小曲中分離篩選得到一株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌株產(chǎn)乙酸乙酯量為2.152 g/L;王濤等[13]從濃香型白酒釀造過程中篩選122株酵母,最高產(chǎn)乙酸乙酯的菌株為畢赤酵母產(chǎn)量為3.74 g/L。與本研究比較可發(fā)現(xiàn)分離出來的產(chǎn)乙醇量最高的酵母q25產(chǎn)乙醇的量明顯低,這可能是因?yàn)榻湍赴l(fā)酵產(chǎn)乙醇受到各種發(fā)酵條件和酵母種類的影響,相關(guān)研究表明,扣囊復(fù)膜酵母一方面可以直接利用淀粉發(fā)酵[14],另一方面可以和釀酒酵母協(xié)同作用在酒精發(fā)酵中發(fā)揮作用[15];酵母m12產(chǎn)乙酸乙酯的量要略高,獲得的產(chǎn)酯性能優(yōu)良的m12菌株可以進(jìn)一步研究發(fā)酵特性,優(yōu)化發(fā)酵條件,提高乙酸乙酯的產(chǎn)量,應(yīng)用于老陳醋的生產(chǎn)過程。

3　結(jié)論

從山西水塔老陳醋釀造大曲中富集分離純化出21株酵母菌,對(duì)形態(tài)學(xué)初步鑒定完全符合酵母特征,進(jìn)一步分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為2株弗比恩酵母,8株扣囊復(fù)膜酵母、6株異常威克漢姆酵母、3株葡萄牙棒孢酵母、2株東方伊薩酵母。

采用靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用的方法測定21株酵母菌發(fā)酵后糯米糖化液的乙醇和乙酸乙酯含量,測定結(jié)果表明產(chǎn)生乙酸乙酯最多的菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)m12,產(chǎn)量為4.4415 g/L,產(chǎn)生乙醇最多的是扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)q25,產(chǎn)量為48.577 g/L,產(chǎn)生最少的則分別為扣囊復(fù)膜酵母q6(含量為0.0037 g/L)和東方伊薩酵母q12(含量為11.4555 g/L)。

本實(shí)驗(yàn)初步研究了從大曲中分離的21株酵母菌的產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯的特性,為進(jìn)一步研究、優(yōu)化大曲提供了數(shù)據(jù)支持。

[1]梁麗絨,呂利華,趙良啟.山西老陳醋釀酒酵母菌共培養(yǎng)體系的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005(12):12-15.

[2]弓曉艷,呂利華,武振宇,等.山西老陳醋產(chǎn)酸功能菌研究[J].食品工業(yè)科技,2010(2):170-173.

[3]呂艷歌,馬海樂,李云亮,等.山西老陳醋產(chǎn)酸菌的分離鑒定及系統(tǒng)學(xué)分析[J].中國食品學(xué)報(bào),2013,13(12):163-171.

[4]楊寧,郭紅珍,郝林.山西老陳醋大曲紅曲霉分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(1):4-6.

[5]呂利華,梁麗絨,趙良啟,等.高糖化酶活菌株的選育及其在山西老陳醋釀造中的應(yīng)用[J].生產(chǎn)與科研經(jīng)驗(yàn),2007,33(9):83-85.

[6]KURTZMAN C P. Phylogeny of the ascomycetous yeasts and the renaming of Pichia anomala to Wickerhamomyces anomalus[J]. Antonie van Leeuwenhoek,2011,99:13-23.

[7]武晉海,郝林,白瑞華.山西老陳醋大曲微生物生態(tài)分布[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004(3):279-282.

[8]弓曉艷.老陳醋釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能研究[D].太原:山西大學(xué),2010.

[9]Esteve-Zarzoso B,Belloch C,Uruburu F,et al.Identification of yeasts by RFLP an alaysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers[J].Int J Syst B.dcteriol,1999(49):329-337.

[10]靳艷玲,甘明哲,方揚(yáng),等.鮮甘薯發(fā)酵生產(chǎn)高濃度乙醇的技術(shù)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(3):410-413.

[11]朱浩里,王澤云,張君,等.不同菌種利用早秈米糖化液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究[J].釀酒,2003(1):17-20.

[12]李銳利.高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的選育及在清香型小曲酒中的應(yīng)用研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學(xué),2011.

[13]王濤,李謹(jǐn)萌,游玲,等.濃香型白酒釀造相關(guān)酵母與發(fā)酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的相關(guān)性[J].食品工業(yè)科技,2014(8):184-187.

[14]張厚程,劉娟,池振明,等.扣囊復(fù)膜酵母菌高產(chǎn)突變株轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生產(chǎn)海藻糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(1):1-4.

[15]呂旭聰,翁星,黃若蘭,等.紅曲黃酒釀造用曲及傳統(tǒng)釀造過程中酵母菌的多樣性研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2012(1):182-189.

Isolation and identification of yeats in Daqu for aged vinegar production and their capacity for producing ethly alcohol and ethly acetate

DONG Kai-feng1,2,AN Na1,2,LI Dong-le1,2,DENG Han-sen1,CHE Jian-tu1,2,*

(1.S&V Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Beijing 102200,China; 2.Shanxi Shuita Vinegar Industry Co.,Ltd.,Taiyuan 030404,China)

Twenty-one yeast strains were isolated from Daqu,a starter participating in fermentation particularly for producing aged vinegar,via conventional yeast culture. The colony and cellular morphological characteristics of the yeasts were observed. The sequence analysis of 26S rDNA(D1/D2 region)from the yeasts was subsequent performed to further identify the strains. The fermentation with each of these yeasts was finally carried out,and ethyl alcohol,as well as ethyl acetate in fermented solution were detected using static headspace-GC-MS for investigation of their function. The results showed that the isolated yeast strains contained 2Cyberlindnerafabianii,8Saccharomycopsisfibuligera,6Wickerhamomycesanomalus,3Clavisporalusitand 2Issatchenkiaorientalisstrains. All isolated yeast strains had capacity to produce ethyl alcohol,but the concentrations were different between the strains. Ethyl acetate was also produced,which concentration was various in different strains. The highest levels of ethyl acetate and ethyl alcohol produced byWickerhamomycesanomalusm12 andaccharomycopsisfibuligeraq25 reached 4.4415 g/L and 48.4577 g/L respectively in fermented liquor,while the lowest levels bySaccharomycopsisfibuligeraq6 andIssatchenkiaorientalisq12 were 0.0037 g/L and 11.4555 g/L. These data indicated that the contribution of the yeast strains in Daqu on producing ethyl alcohol and ethyl acetate for aged vinegar might be different.

Daqu(used for aged vinegar production only);yeast;static headspace gas chromatographymass spectrometry;ethyl ethanol;ethyl acetate

2015-10-19

董凱鋒(1984-)，男，碩士研究生，主要從事發(fā)酵食品原理與技術(shù)方面的研究，E-mail：dongfeng2005485@163.com。

車建途(1952-)，男，博士，教授，主要從事分子微生物以及藥理學(xué)方面的研究，E-mail：chejiantu@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0213-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.035