李　杰,趙聲蘭,陳朝銀,*

(1.昆明理工大學(xué),生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院,云南昆明 650500)

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核桃青皮果蔬酵素的成分組成及體外抗氧化活性研究

李杰1,趙聲蘭2,陳朝銀1,*

(1.昆明理工大學(xué),生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院,云南昆明 650500)

化學(xué)成分,活性酶,抗氧化功效,核桃青皮果蔬酵素

核桃青皮,作為核桃的一種主要廢棄物,含有大量的沒食子酸、胡桃醌、鞣質(zhì)、α-氫化胡桃醌-4-葡萄糖苷、胡桃醌生物堿和萘醌等活性成分,具有抗自由基、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效[1],在民間被廣泛用于治療癌癥,配制藥酒和利口酒等。在植物酵素研究如火如荼的背景下,將核桃青皮經(jīng)微生物發(fā)酵制成核桃青皮酵素,是核桃產(chǎn)業(yè)頗具前景和新意的方向,同時(shí),也將顯現(xiàn)出其優(yōu)良的環(huán)保和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。酵素中含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、低聚糖、多酚、黃酮、酶和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分,具有美白抗氧化、抗菌消炎、潤(rùn)腸通便、解酒護(hù)肝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、修復(fù)機(jī)體損傷等保健功能[2-7]。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶是植物酵素的主要功效酶[8],因此微生物酵素還具有助消化、降脂減肥、抗自由基的功效。探究核桃青皮果蔬酵素的化學(xué)組成、功能成分和抗氧化活性,對(duì)于開發(fā)優(yōu)質(zhì)酵素和科學(xué)評(píng)估酵素質(zhì)量具有一定的指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乙二胺四乙酸(EDTA)、沒食子酸、蘆丁、硫辛酸、抗壞血酸(VC)、原花青素、福林酚、鄰菲咯啉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,6-二溴苯醌氯亞胺(DBQC)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;乙醇、鹽酸、葡萄糖、碳酸鈉、硝酸鋁、香草醛、氯化鐵分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;蛋白試劑盒、淀粉酶試劑盒、礦物質(zhì)(鉀、鈉、鎂、鐵、鈣、鋅、磷、氯)試劑盒長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒南京建成生物工程研究所;核桃青皮云南省漾濞彝族自治縣;果蔬云南省昆明市呈貢新區(qū)尚優(yōu)瑪特超市。

紫外分光光度計(jì)Amersham Biosciences公司;Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀賽默飛世爾儀器有限公司;半自動(dòng)生化分析儀吉林維爾醫(yī)療器械有限公司;電子分析天平上海天平儀器廠;電子恒溫水浴鍋鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;pH計(jì)上海精密儀器儀表有限公司;渦旋振蕩器上海納茲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1核桃青皮果蔬酵素制備的主要流程

1.2.2化學(xué)成分分析總糖含量測(cè)定采用蒽酮硫酸法[9],通過葡萄糖標(biāo)曲回歸方程(y=6.375x-0.0249,R2=0.9969)計(jì)算;酸度測(cè)定采用電位滴定法[10],以酒石酸計(jì)量;可溶性固形物測(cè)定按照GB 12295-1990《水果、蔬菜制品可溶性固形物含量測(cè)定》;蛋白質(zhì)含量測(cè)定使用蛋白質(zhì)試劑盒,測(cè)定步驟按說明書進(jìn)行;礦物質(zhì)(鉀、鈉、鎂、鐵、鈣、鋅、磷)含量測(cè)定使用相應(yīng)試劑盒,測(cè)定步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.3功效酶活性測(cè)定

式中:A樣品為不加ddH2O和Dilutionbuffer的吸光值;A空白1為不加樣品液和Dilutionbuffer的吸光值;A空白2為不加樣品液和酶工作液的吸光值；A空白3為不加ddH2O和酶工作液的吸光值。

SOD活力(U/mL)=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)

1.2.3.2淀粉酶活性測(cè)定采用碘-淀粉比色法:按照淀粉酶測(cè)定試劑盒說明書在半自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行。

1.2.4主要抗氧化成分分析

1.2.4.1總酚含量測(cè)定總酚含量采用改良的Folin-Ciocaltu比色法測(cè)定[12],沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。移取1mL樣品液與5mL超純水和2.5mL10%Folin-Ciocaltu試劑混合,混勻靜止3min后加入1mL12%碳酸鈉溶液,最后用超純水定容至25mL,45 ℃水浴反應(yīng)0.5h,在696nm處測(cè)定吸光值,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程避光操作?？偡雍客ㄟ^沒食子酸標(biāo)曲回歸方程(y=0.07243x-0.00091,R2=0.99967)計(jì)算。

1.2.4.2總黃酮含量測(cè)定總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定[13],蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。2mL樣品液與3mL超純水、0.3mL5%的NaNO2充分混勻,靜置反應(yīng)6min后,加入0.3mL10%AlNO3,再靜置反應(yīng)6min,加入4mL4%的NaOH溶液和0.4mL30%乙醇,充分混勻,室溫靜置15min,在510nm處測(cè)吸光值。總黃酮含量通過蘆丁標(biāo)曲回歸方程(y=12.93x-0.0123,R2=0.9996)計(jì)算。

1.2.4.3VC含量測(cè)定VC含量采用紫外分光光度法測(cè)定[14],基于VC對(duì)堿的不穩(wěn)定性。堿處理前:1mL樣品液與2mL10%鹽酸混合,然后用超純水稀釋至50mL,在243nm處測(cè)吸光值;堿處理后:1mL樣品液與10mL超純水和4mLNaOH(1mol/L)混勻,靜置反應(yīng)20min,加入4mL10%鹽酸,最后用超純水定容至50mL,在243nm處測(cè)吸光值。VC含量以堿處理前后的吸光度差值代入標(biāo)曲回歸方程(y=0.1108x+0.0013,R2=0.999)并結(jié)合下式計(jì)算:

式中:C為依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的VC濃度;V總為樣品液定容總體積;V1為測(cè)吸光度時(shí)吸取樣品液體積。

1.2.4.4總花青素測(cè)定總花青素含量采用香草醛-鹽酸法測(cè)定[15],原花青素為標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)中,顯色劑由等體積的2%香草醛和20%的鹽酸配制。1mL樣品液與5mL顯色劑混合,30 ℃水浴反應(yīng)8min,在496nm處測(cè)吸光值?？偦ㄇ嗨睾客ㄟ^原花青素標(biāo)曲回歸方程(y=0.0017x+0.0049,R2=0.9928)計(jì)算。

1.2.5核桃青皮果蔬酵素的抗氧化活性

1.2.5.1核桃青皮果蔬酵素對(duì)DPPH·清除作用2.0mL樣品液與2.0mLDPPH溶液(0.1mol·L-1于乙醇中)混勻,暗室靜置反應(yīng)30min,在517nm處測(cè)吸光值[16]。DPPH·清除率用下式計(jì)算:

式中:A1為DPPH+樣品液的吸光值:A0為樣品液+乙醇的吸光值;A2為DPPH+乙醇的吸光值。

式中:A1為不加樣品液的吸光值;A2為超純水代替鄰苯三酚的吸光值;A3為加樣品液的吸光值。

1.2.5.3核桃青皮果蔬酵素對(duì)·OH清除作用1 mL鄰菲咯啉(0.75 mmol/L)、3.8 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7.4)和1.5 mL Fe2SO4(0.75 mmol/L)混勻,而后1 mL樣品液和1 mL 0.01% H2O2加入到該混合物中,37 ℃水浴反應(yīng)60 min,在536 nm處測(cè)吸光值[18]?！H清除率通過下式計(jì)算:

式中:A1為樣品的吸光值;A2為不加樣品的吸光值;A3為不加樣品和H2O2的吸光值。

1.2.5.4核桃青皮果蔬酵素的總抗氧化性總抗氧化能力由鉬酸銨還原法測(cè)定[19],VC做參照。1 mL樣品液與1 mL反應(yīng)試劑(4 mmol/L鉬酸銨,0.6 mol/L H2SO4和28 mmol/L Na3PO3)混勻,90 ℃水浴反應(yīng)90 min,待冷卻至室溫后,在695 nm處測(cè)吸光值。

1.2.5.5核桃青皮果蔬酵素的還原力VC作參照,1 mL樣品液與2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)、2.5 mL 1% K3Fe(CN)6混合,50 ℃水浴反應(yīng)20 min后,加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。然后3000×g離心10 min,取2.5 mL上清液與2.5 mL超純水、0.5 mL 0.1% FeCl3混合,靜置反應(yīng)10 min后在700 nm處測(cè)吸光值[20]。

1.2.5.6核桃青皮果蔬酵素的金屬螯合能力EDTA作參照。取1 mL樣品液與0.5 mL FeCl2(1.0 mmol/L)混合,充分混勻后,加入1 mL菲洛嗪(5.0 mmol/L)并用超純水定容至5 mL,靜置反應(yīng)10 min,在562 nm處測(cè)吸光值[21]。核桃青皮果蔬酵素金屬螯合能力通過下式計(jì)算:

式中:A為加樣品吸光值;A0為不加樣品的吸光值。

1.2.6數(shù)據(jù)分析每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,采用Origin Pro8.0和Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。成分測(cè)定結(jié)果以平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示?？寡趸钚詼y(cè)定結(jié)果以平均值表示。

2　結(jié)果與分析

2.1化學(xué)成分、功效酶活、主要抗氧化成分分析結(jié)果

核桃青皮果蔬酵素基本成分分析結(jié)果見表1。由表1可知,核桃青皮果蔬酵素的可溶性固形物、酸度和總糖含量分別為29.3%、1.959%和11.8 mg/mL,據(jù)賈麗麗報(bào)道冬棗酵素的可溶性固形物和酸度含量分別為7.97%和0.4%[22],可看出核桃青皮果蔬酵素的可溶性固形物和酸度均高于冬棗酵素,通過感官品嘗,核桃青皮果蔬酵素液酸甜適口,伴有濃郁的果醋香,這顯示了酵素良好食用特性。核桃青皮果蔬酵素的總蛋白含量為39.0 mg/mL,是樹莓酵素總蛋白含量的10倍多[23],可以看出核桃青皮果蔬酵素是蛋白質(zhì)攝取的不錯(cuò)來源。由2013版《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量(DRIs)》可知,K、Na、Ca、P、Mg、Cl是需要量較多的宏量元素,Fe和Zn是需要量較少的微量元素,其中K、Na、Ca、P、Mg、Fe、Zn的推薦攝入量(RNIs)分別為2000、2200、800、700、350、15～20、11.5～15.5 mg/d。由表2看出,核桃青皮果蔬酵素含有這8種礦物元素,且宏量元素K、Na、Ca、P、Mg的含量相較微量元素Fe、Zn更為豐富,可作為礦物質(zhì)攝取較為全面的理想來源。

表1　核桃青皮果蔬酵素化學(xué)成分、功效酶活、主要抗氧化成分分析結(jié)果

用WST-1法測(cè)定了核桃青皮果蔬酵素中SOD活性,當(dāng)濃度為10%時(shí),抑制率達(dá)到了95.6%,由稀釋倍數(shù)算出酵素內(nèi)SOD活性達(dá)到1980.25 U/mL,淀粉酶活性為0.96 U/mL。據(jù)報(bào)道火龍果酵素內(nèi)SOD和淀粉酶活性分別為300 U/mL和33.2 U/mL[8],可看出核桃青皮果蔬酵素相比火龍果酵素發(fā)酵具有更強(qiáng)的SOD活性和較低的淀粉酶活性,這顯示核桃青皮果蔬酵素具有更優(yōu)的清除自由基能力,同時(shí)也有一定的助消化功效。

表2　核桃青皮果蔬酵素礦物質(zhì)成分分析結(jié)果

由表1可以看出,核桃青皮果蔬酵素的4種主要抗氧化成分中,VC、總黃酮和總花青素含量相比總多酚較高,分別達(dá)到了1.096、0.853和0.855 mg/mL,其總黃酮含量與冬棗酵素的總黃酮含量相當(dāng)[22]。然而,總多酚含量?jī)H為0.188 mg/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于葡萄酵素的多酚含量[2],可能是由于發(fā)酵過程中多酚與其他大分子物質(zhì)結(jié)合成了大分子復(fù)合物。

2.2核桃青皮果蔬酵素的抗氧化功效

Table 3IC50values of walnut green husk fruit and vegetable

IC50DPPH·O-2··OH核桃青皮果蔬酵素(%)0.461.884.83火龍果酵素(%)[8]4.6020.0050.00

DPPH·以氮為中心,是短時(shí)間內(nèi)評(píng)判物質(zhì)抗氧化活性較為穩(wěn)定和廣泛的方法[24]。不同濃度的核桃青皮果蔬酵素對(duì)DPPH·清除率見圖1。由圖1看出,隨著濃度的增加,清除率逐漸增大。1%的核桃青皮果蔬酵素對(duì)DPPH·清除率達(dá)到93.62%,與董銀卯報(bào)道的10%的火龍果酵素對(duì)DPPH·清除率相當(dāng)[8],這表明核桃青皮果蔬酵素對(duì)DPPH·具有更強(qiáng)的清除能力,分析原因可能是由于核桃青皮果蔬酵素中VC、黃酮、總花青素和多酚協(xié)同作用的結(jié)果。

圖1　不同濃度的核桃青皮果蔬酵素對(duì)DPPH·的清除能力Fig.1　Scavenging activity of the walnut green husk fruit and vegetable compound ferment on DPPH· at different concentration

圖2　不同濃度的核桃青皮果蔬酵素對(duì)·自由基的的清除能力Fig.2　Scavenging activity of the walnut green husk fruit and vegetable compound ferment on · radicals at different concentration

圖3　不同濃度的核桃青皮果蔬酵素對(duì)·OH自由基的的清除能力Fig.3　Scavenging activity of the walnut green husk fruit and vegetable compound fermenton ·OH radicals at different concentration

2.2.2核桃青皮果蔬酵素的總抗氧化性總抗氧化性的測(cè)定是基于抗氧化劑可使Mo(Ⅵ)還原為Mo(Ⅴ),并在酸性條件下產(chǎn)生綠色Mo(V)的磷酸鹽。以吸光值評(píng)價(jià)總抗氧化性,吸光值越大表示總抗氧化性越強(qiáng)。從圖4得出,核桃青皮果蔬酵素濃度為3.5%時(shí),其吸光值為0.248。140 μg/mL VC吸光值為0.528,2.5%的核桃青皮果蔬酵素的總抗氧化性約相當(dāng)于20 μg/mL VC的總抗氧化性。

圖4　不同濃度的核桃青皮果蔬酵素和VC的總抗氧化性Fig.4　Total antioxidant activity values ofthe walnut green husk fruit and vegetable compound ferment and VC at different concentration

2.2.3核桃青皮果蔬酵素的還原力從還原力測(cè)定結(jié)果(圖5)可知,核桃青皮酵素和VC的還原力均表現(xiàn)出濃度依賴效應(yīng),兩者的還原力均隨濃度的增加而增大。核桃青皮果蔬酵素濃度為7%時(shí),其吸光值為0.766。140 μg/mL VC吸光值為0.778,可見,7%的核桃青皮果蔬酵素還原力與140 μg/mL VC的還原力近似相當(dāng)。

圖5　不同濃度的核桃青皮果蔬酵素和VC的還原力Fig.5　Reducing power values of the walnut green husk fruit and vegetable compound ferment and VC at different concentration

2.2.4核桃青皮果蔬酵素的金屬螯合能力過渡金屬作為反應(yīng)催化劑的活性中心,可通過抑制其與催化劑底物的結(jié)合來達(dá)到抗氧化作用。核桃青皮果蔬酵素對(duì)Fe2+的螯合作用見圖6。從圖6中看出,EDTA濃度在10～70 μg/mL時(shí),其對(duì)Fe2+的螯合作用在21.68%～92.17%。而核桃青皮果蔬酵素原液對(duì)Fe2+的螯合作用最大僅為8.4%,由此看出桃青皮果蔬酵素的金屬螯合能力較差。

圖6　不同濃度的核桃青皮果蔬酵素和EDTA對(duì)Fe2+的螯合作用Fig.6　The chelating activity for the walnut green husk fruit and vegetable compound ferment and EDTA to Fe2+ at different concentration

3　結(jié)論

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Chemical composition andinvitroantioxidant properties of walnut green husk fruit and vegetable compound ferment

LI jie1,ZHAO Sheng-lan2,CHEN Chao-yin1,*

(1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Faculty of Chinese Traditional Medicine,Yunnan University of Chinese Traditional Medicine,Kunming 650500,China)

Using the walnut green husk,fruit and vegetable as raw materials,the ferment of walnut green husk with fruits and vegetables was made through twice fermentation and filtration. In this study,chemical composition,bioactive enzymes and the major antioxidant components of the ferment were determined,and simultaneously antioxidant activities was investigated. The results indicated that the content of soluble solids,acidity,total sugar and protein in the ferment of walnut green husk with fruit and vegetable were 29.300%,1.959%,11.802 mg/mL and 39.000 mg/mL,respectively. After fermentation,the ferment of walnut green husk with fruit and vegetable became mellow,with a sweet-sour flavor. Moreover,the ferment was rich in the species of minerals which showed K>Cl>Mg>Na>Ca>P>Fe>Zn. SOD activity reached 1980.250 U/mL,while the activity of amylase was lower. The major antioxidant components had different levels with a descending amount of ascorbic acids,proanthocyanidin,total flavonoids and total polyphenol,the content of total flavonoids was similar to winter-jujube ferment,while the content of total polyphenol was far below the grape ferment. In addition,compared with pitaya ferment,the ferment of walnut green husk with fruit and vegetable possessed higher anti-free radical activity,at the same time showed good reducing power,total antioxidant capacity and poor metal ion-chelating activity.

chemical composition;bioactive enzymes;antioxidant activities;ferment of walnut green husk with fruit and vegetable

2015-09-08

李杰(1989-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù)與工程,E-mail:s2009140347@163.com。

陳朝銀(1948-),男,教授,研究方向：云南特色優(yōu)勢(shì)生物資源的研究與開發(fā),E-mail:13700693357@163.com。

科技部支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD46B00);國(guó)家自然科學(xué)基金(21466037);云南教育廳科技重大專項(xiàng)(ZD2014009)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)10-0117-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.014