蘇秀蘭，王翔

(1.四川文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川達(dá)州635000；2.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津300387)

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臍血血紅蛋白體外氧化還原研究

蘇秀蘭1，王翔2

(1.四川文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川達(dá)州635000；2.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津300387)

研究無基質(zhì)臍血血紅蛋白體外條件下的氧化和還原反應(yīng)，在血紅蛋白溶液中加入一定量的氧化劑和還原劑，測定氧飽和度和高鐵血紅蛋白含量隨時間的變化。結(jié)果表明：自氧化時，4 h內(nèi)高鐵血紅蛋白含量由5%升高至35%；疊氮鈉催化氧化時，4 h內(nèi)高鐵血紅蛋白含量由5%升高至65%；加入VC后，3 h內(nèi)高鐵血紅蛋白含量由45%降至5%左右。無基質(zhì)血紅蛋白在體外條件極易被氧化；VC的加入能夠有效抑制高鐵血紅蛋白含量，且其對血紅蛋白溶液的還原順序?yàn)椋合惹宄芙庋?，再清除結(jié)合氧，最后還原高鐵血紅蛋白；同時加入氮氧自由基，并不能加速VC對高鐵血紅蛋白的還原，但明顯縮短了還原時間。

血液代用品；臍血血紅蛋白；氮氧自由基；氧化還原

引言

輸血是臨床最常用的醫(yī)療手段之一。目前，醫(yī)院輸血所采用的血源多是購買或者志愿者捐獻(xiàn)的未經(jīng)處理的血液[1]。這種血液使用起來簡單方便，但也存在一些問題，如血液來源不足，經(jīng)常性庫存緊張[2]；容易造成病毒的交叉感染[3-4]；可能引起多種副作用，如腦血管收縮[5]和腎損傷[6]等。正因如此，開發(fā)出一種安全可靠的血液代用品是世界性的研究課題。

臍帶血是胎兒娩出斷臍后殘留在臍帶和胎盤絨毛血管內(nèi)的血。每只胎盤可采血80～150 mL。全國每年新出生嬰兒數(shù)量巨大，因此，如果把胎盤血應(yīng)用于血液代用品的制備，可在一定程度上解決紅細(xì)胞代用品的血源受限問題[7-8]。血紅蛋白(Hb)表面的膜基質(zhì)及其它雜蛋白能夠引起腎毒性和凝血，血紅蛋白類氧載體(HBOC)采用的多是經(jīng)過一定破膜、離心處理的無基質(zhì)血紅蛋白[9-10]。但處理后得到的無基質(zhì)血紅蛋白同時也失去了細(xì)胞內(nèi)還原酶系統(tǒng)(如超氧化物岐化酶、過氧化物酶和高鐵血紅蛋白還原酶)的調(diào)節(jié)，可能造成Fe2+Hb被氧化成Fe3+Hb(Met-Hb)，失去攜氧能力，且易導(dǎo)致細(xì)胞自由基損傷[11-12]。

維生素C(VC)是HBOC中最常用的Fe3+Hb還原劑，但VC對血紅蛋白溶液的還原順序，目前研究得仍不夠充分。氮氧自由基(TEMPO)是一種高效的可控活性自由基，生物實(shí)驗(yàn)證實(shí)氮氧自由基具有淬滅生物體內(nèi)過量自由基的作用[13]。劉有成[14-15]等發(fā)現(xiàn)，TEMPO能與VC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成相應(yīng)的羥胺。VC為水溶性還原劑，而羥胺則是油溶性還原劑，推測其應(yīng)該更易接近血紅蛋白。但在VC還原體系中加入TEMPO，是否能加速VC對高鐵血紅蛋白的還原速率，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

1　材料和儀器

1.1血液

新鮮臍帶血由天津協(xié)和干細(xì)胞基因工程公司提供。

1.2試劑

TEMPO(Sigma公司)；疊氮鈉(阿拉丁試劑)；維生素C(天津文達(dá))；高純氮(成都和平氣體)。

1.3儀器

752型紫外-可見分光光度計(jì)(上海精科儀器設(shè)備有限公司)；TGL-16M離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫水浴鍋(鞏義市 予華儀器有限責(zé)任公司)；SHZD(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；微量移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；MIK-DO530溶氧儀(美控(中國)儀器有限公司)；高壓滅菌釜(力辰科技有限公司)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1無基質(zhì)臍血血紅蛋白制備

[16]方法制備無基質(zhì)臍血血紅蛋白。

2.2Met-Hb含量及氧飽和度測定[17]

分別測定血紅蛋白溶液在523 nm、540 nm、554 nm和576 nm波長處的吸光度，經(jīng)過計(jì)算可得Met-Hb含量及氧飽和度。

1.8814×OxyHb%+1.4773×DeoxyHb%+0.8419×MetHb%=A540/A523

1.2539×OxyHb%+1.8095×DeoxyHb%+0.6161×MetHb%=A554/A523

2.0201×OxyHb%+1.3345×DeoxyHb%+0.5473×MetHb%=A576/A523

Y=OxyO2Hb/ (OxyHb+DeoxyHb)

其中，Oxy-Hb、Met-Hb和Deoxy-Hb分別為氧合血紅蛋白、高鐵血紅蛋白和脫氧血紅蛋白，A523、A540、A554和A576分別為523 nm、540 nm、554 nm和576 nm下的吸光度。

2.3臍血血紅蛋白氧化實(shí)驗(yàn)[18]

2.3.1臍血血紅蛋白自氧化

取無基質(zhì)臍血血紅蛋白，用PBS(0.2 mol/L，pH7.4)稀釋至25 μmol/L。加入一定量的EDTA，使其終濃度為300 μmol/L。轉(zhuǎn)入已滅菌的錐形瓶中，37℃水浴密封保存。每隔1 h取出適量，在500～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，并計(jì)算Met-Hb含量，4 h后終止。

2.3.2疊氮鈉催化臍血血紅蛋白氧化

如2.3.1所述配制臍血血紅蛋白的EDTA溶液，加入一定量的疊氮鈉，使其終濃度為0.1 mol/L。轉(zhuǎn)入滅菌處理的錐形瓶中，37℃水浴密封保存。每隔0.5 h取出適量, 在500～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，并計(jì)算Met-Hb含量，3 h后終止。

2.4臍血血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)

2.4.1封閉體系內(nèi)Met-Hb的還原

用PBS(0.2 mol/L，pH7.4)將制得的無基質(zhì)臍血血紅蛋白溶液稀釋至2.5 μmol/dL，分別加入一定量的VC(終濃度為100 μmol/dL)，TEMPO(終濃度為30 μmol/dL)及其混合體系。37℃水浴密封保存。每隔20 min取出適量測吸光度，計(jì)算Met-Hb含量及氧飽和度。

2.4.2脫氧-封閉體系內(nèi)Met-Hb的還原

用PBS(0.2 mol/L，pH7.4)將制得的無基質(zhì)臍血血紅蛋白溶液稀釋至2.5 μmol/dL，不間斷脫氧-通氮，直至溶液中的溶解氧被完全除去。然后分別加入一定量的VC(終濃度為100 μmol/dL)，TEMPO(終濃度為30 μmol/dL)及其混合體系。37℃水浴密封保存。每隔20 min取出適量測吸光度，計(jì)算Met-Hb含量及氧飽和度。

2.5溶氧量測定

用PBS(0.2 mol/L ，pH7.4)將制得的無基質(zhì)臍血血紅蛋白溶液稀釋至2.5 μmol/dL，加入3倍量VC，每隔10 min測一次溶氧量。根據(jù)溶氧量、氧飽和度以及Met-Hb含量隨時間的變化關(guān)系，即可知還原劑對血紅蛋白溶液的還原順序。

3　結(jié)果與討論

3.1血紅蛋白氧化

3.1.1血紅蛋白自氧化

圖1(a)為37℃時，臍血血紅蛋白溶液在500～700 nm范圍內(nèi)隨時間變化的全波長掃描圖。由圖1(a)可知，吸光度的峰值出現(xiàn)在541 nm和576 nm處，并在625 nm處出現(xiàn)一小的吸收峰，兩個等吸收點(diǎn)分別為524 nm和589 nm。圖1(b)為Met-Hb含量隨時間的變化趨勢(4 h)，每隔1 h測一次，體外條件下，臍血無基質(zhì)血紅蛋白極易被氧化，MetHb含量隨時間不斷升高，4 h內(nèi)由5%升至35%。

圖1　血紅蛋白自氧化的影響

3.1.2疊氮鈉催化血紅蛋白氧化

圖2(a)為37℃時，疊氮鈉催化作用下臍血血紅蛋白溶液在500～700 nm范圍內(nèi)隨時間變化的全波長掃描圖(3 h)。經(jīng)對比可知，其與自氧化全波長掃描圖曲線走勢相似。圖2(b)為Met-Hb含量隨時間的變化趨勢(3 h)。每隔0.5 h測一次，疊氮鈉的催化作用加速了血紅蛋白的氧化，Met-Hb含量3 h內(nèi)由5%升高至65%。

圖2　疊氮鈉催化下血紅蛋白氧化的影響

3.2VC、TEMPO及其復(fù)合體系對血紅蛋白溶液的還原

3.2.1封閉體系內(nèi)血紅蛋白溶液的還原

由圖3可知，不加入還原劑時，溶液氧飽和度和Met-Hb含量均不隨時間變化。加入還原劑VC或者VC與TEMPO的復(fù)合體系后，氧飽和度和Met-Hb含量均隨時間有顯著下降。且從時間上看，血紅蛋白氧飽和度下降到接近零時，Met-Hb含量才開始下降。圖3(b)顯示，三條曲線下降的斜率接近，而斜率反映的是下降速率，即無論加入TEMPO與否及加入量多少，VC對Met-Hb的還原速率并未發(fā)生變化。這可能是因?yàn)椋m然TEMPO與VC反應(yīng)生成的羥胺更易靠近血紅蛋白，但由于所加VC已是過量，而羥胺的還原性并不是很強(qiáng)，因此對反應(yīng)的加速并不明顯。但加入TEMPO后，發(fā)現(xiàn)曲線下降位點(diǎn)左移，即TEMPO的加入能夠改變VC還原Met-Hb的起始時間。

圖3　封閉體系內(nèi)臍血血紅蛋白的還原

3.2.2脫氧-封閉體系內(nèi)血紅蛋白溶液的還原

通過抽真空及充氮的處理，血紅蛋白溶液中的溶解氧基本被除去。圖4(a)顯示，加入還原劑后，還原劑直接開始清除結(jié)合氧，氧飽和度立即下降。不加入任何還原劑時，氧飽和度仍下降。這是因?yàn)槊撗跆幚硎谷芤褐醒醴謮哼^低，血紅蛋白的一部分結(jié)合氧被釋放到溶液中。脫氧-封閉體系內(nèi)Met-Hb含量的變化趨勢與封閉體系相似，即脫氧-封閉體系加入TEMPO后，VC還原Met-Hb的速率基本無變化。但同樣還原Met-Hb的時間也提前。

圖4　脫氧-封閉體系臍血血紅蛋白的還原

3.3VC對血紅蛋白溶液的還原順序

圖5(a)顯示，加入還原劑VC后，血紅蛋白溶液溶氧量隨時間迅速下降，大約在50 min溶液中溶解氧被清除殆盡。由圖5(b)可知溶液氧飽和度大約在50 min時開始下降，90 min時下降到最低值。而Met-Hb在80 min之后才開始被還原。從時間上，三者依次進(jìn)行?？梢哉J(rèn)為VC對血紅蛋白溶液的還原順序?yàn)椋合瘸芤褐械娜苎?，再清除血紅蛋白的結(jié)合氧，最后還原Met-Hb。

圖5　VC對血紅蛋白溶液的還原順序

4　結(jié)論

(1)無基質(zhì)臍血血紅蛋白在體外條件下，極易被氧化成Met-Hb。自氧化時，Met-Hb含量4 h內(nèi)由5%升高至35%，而疊氮鈉催化作用下，氧化更明顯，Met-Hb含量3 h內(nèi)由5%升高至65%，完全喪失攜氧能力。

(2)VC的加入能夠有效抑制Met-Hb的升高，但同時引入自由基清除劑TEMPO，卻不能加速VC對Met-Hb的還原，僅縮短了還原的時間。

(3)VC對臍血血紅蛋白溶液的還原順序?yàn)椋合惹宄芤褐械娜芙庋酰偾宄t蛋白結(jié)合氧，最后還原Met-Hb。

參 考 文 獻(xiàn)：

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The Redox Reaction of Placenta Hemoglobin in Vitro

SU Xiulan1, WANG Xiang2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Sichuan University of Arts and Science, Dazhou 635000, China; 2.School of Environmental and Chemical Engineering, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387, China)

The purpose of this paper is to research the redox reactions of hemoglobin in vitro. The content of methemoglobin and oxygen saturation is measured with time going by when oxidant and reductant is added into hemoglobin solution. The content of methemoglobin is climbing from 5% to 35% by autoxidation and from 5% to 65% by sodium azide mediated oxidation; however, the content of methemoglobin is reducing from 45% to 5% when VC is added. Placenta hemoglobin is oxidized easily in vitro; VC could reduce the content of methemoglobin effectively and the restore sequence is cleaning dissolved oxygen firstly, then consuming bound oxygen, and reducing methemoglobin lastly; TEMPO could shorten the time of reducing, but it could not led to faster reduction rate.

blood substitute; placenta hemoglobin; TEMPO; redox reaction

2016-01-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21202117/B020703)

蘇秀蘭(1988-)，女，安徽阜陽人，助教，碩士，主要從事血液代用品方面的研究，(E-mail)suxiulan@126.com

1673-1549(2016)02-0009-05

10.11863/j.suse.2016.02.03

Q51

A