張嬙，葉明（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院，安徽合肥230009）

擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的研究

張嬙1，2，葉明2，*
（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院，安徽合肥230009）

探討擬青霉屬產(chǎn)胞外多糖和菌絲體生物量最大時(shí)的液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化，主要考察培養(yǎng)基組分、碳氮比和物理參數(shù)這三方面的影響。結(jié)果表明，最適培養(yǎng)基配方為葡萄糖30 g/L、酵母膏20 g/L、KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L。最適培養(yǎng)條件為27℃，搖床轉(zhuǎn)速400r/min，培養(yǎng)時(shí)間為7d。在此條件下，擬青霉屬胞外多糖的產(chǎn)量為2.51g/L，菌絲體生物量為23.5g/L。

擬青霉屬；胞外多糖；菌絲體生物量

近年來，許多從蘑菇分離得到的天然多糖和多糖蛋白復(fù)合物已被用于藥物治療。研究證明，擔(dān)子菌類蘑菇多糖具有很強(qiáng)的藥效，如預(yù)防腫瘤、直接抵抗腫瘤、與化學(xué)藥物協(xié)同抗擊腫瘤及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用［1-2］。

擬青霉菌，是一類子囊菌昆蟲病原真菌，據(jù)報(bào)道有很多的生物活性，如抗腫瘤，抗免疫過敏和抗氧化活性［3-4］。天然子實(shí)體的產(chǎn)量是有限的，采用人工培育子實(shí)體已被證明難以實(shí)現(xiàn)。然而，采用最佳的液體培養(yǎng)條件，在發(fā)酵罐內(nèi)的菌絲體和生物活性分子可以顯著增加，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間及受污染程度。大量研究表明，可以通過微生物液體培養(yǎng)，使其代謝產(chǎn)生胞內(nèi)或胞外生物活性成分，這可應(yīng)用于保健食品［5］。目前基于菌體次生代謝產(chǎn)物的液體培養(yǎng)條件優(yōu)化已有大量研究，但關(guān)于擬青霉菌的液體培養(yǎng)近幾年才有所報(bào)道。

菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如碳和氮，在細(xì)胞增殖和代謝生物合成中有重要作用，培養(yǎng)基質(zhì)中組分對(duì)于任何發(fā)酵物質(zhì)的產(chǎn)量都很重要。因此，如果可以克服擬青霉菌在液體培養(yǎng)基內(nèi)的拮抗性，培養(yǎng)的菌絲體和其代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)就可應(yīng)用于食品加工［6］。因此，本文的目的就是基于菌絲體生物量和胞外多糖的量，優(yōu)化擬青霉菌液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以期為開發(fā)出安全、高效的擬青霉菌多糖保健品提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

擬青霉菌菌株：分離并保存于北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院微生物資源實(shí)驗(yàn)室。

1.2微生物和液體培養(yǎng)

菌絲生長的培養(yǎng)基為YMP：10.0g/L葡萄糖、10.0g/L酵母膏、15.0 g/L麥芽提取物、10.0 g/L蛋白胨。

5L發(fā)酵罐內(nèi)菌絲體生長的培養(yǎng)基：30.0g/L葡萄糖、20 g/L酵母膏、0.5g/L KH2PO4、0.1 g/L CuCl2·2H2O。

種子液制備：250 mL搖瓶中裝入含有8 mL活性原液的50 mL YMP培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d。對(duì)于菌絲體的增長，菌絲體用高速攪拌機(jī)混合均勻，2%的種子培養(yǎng)基注入50 mLYMK基質(zhì)，置于搖床培養(yǎng)8 d（27℃，200 r/min）后，然后在5L發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵。接種量為2%（體積比）。為了考察各參數(shù)對(duì)胞外多糖的影響，通風(fēng)比從0.5 vvm增加至1.5vvm，攪拌速度從100r/min變化至500r/min。

1.3菌絲體生物量和胞外多糖的測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后，不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵液于5 000 r/min離心20min。菌絲體水洗3次，50℃低溫烘干。發(fā)酵液透析后，用3倍體積乙醇沉淀，4℃靜置過夜，0.45 mm濾紙過濾，沉淀于60℃干燥至恒重。胞外多糖的計(jì)算采用苯酚-硫酸法［7］。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

在本試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均平行3次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2　結(jié)果與討論

2.1溫度和初始pH的影響

為了研究溫度對(duì)菌絲體生長和胞外多糖（EPS）產(chǎn)生的影響，在擬青霉菌培養(yǎng)過程中改變不同的溫度（15℃～33℃），其它條件不變，發(fā)酵后測(cè)定多糖及生物量，結(jié)果見圖1。

圖1　溫度對(duì)擬青霉菌菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1　The effect of temperature on mycelium growth and EPS production

如圖1所示，基于擬親霉胞外多糖產(chǎn)率選取最佳的培養(yǎng)溫度，EPS產(chǎn)生的最適培養(yǎng)溫度為27℃。此時(shí)，菌絲體生物量雖然不是最大，但對(duì)于擬青霉發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，在27℃時(shí)更有利于代謝產(chǎn)生。故選取27℃作為發(fā)酵溫度。

在培養(yǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)pH對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和代謝物合成有顯著影響。本試驗(yàn)中，改變初始pH4.0～11.0，結(jié)果如圖2所示。

圖2　初始pH對(duì)菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2　The effect of pH on mycelium growth and EPS production

如圖2所示，在弱酸或中性環(huán)境（pH 5.0～8.0）下，能夠產(chǎn)生較多的菌絲體和EPS，其在中性pH條件下，更適宜液體培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長和EPS的產(chǎn)生，而且菌絲體會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，這會(huì)降低中性pH至適宜培養(yǎng)條件。

2.2碳源和氮源的影響

擔(dān)子菌的液體培養(yǎng)過程中，不同的碳源會(huì)影響菌絲體的生長及其代謝產(chǎn)物。為了找到擬青霉菌的菌絲體生長和EPS產(chǎn)生的適宜碳源，1.0%（g/mL）的不同碳源在無糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d。結(jié)果如圖3所示。

圖3　碳源對(duì)擬青霉菌菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3　The effect of different carbon source on mycelium growth and EPS production

研究發(fā)現(xiàn)，與無糖培養(yǎng)基相比，含有碳源的培養(yǎng)基利于菌絲體生長。在含有各種碳源的培養(yǎng)基中，葡萄糖做碳源的培養(yǎng)基產(chǎn)生EPS最多，其次是淀粉（圖3）。因此，葡萄糖被作為主要的碳源，這是由于其價(jià)格低廉、易于工業(yè)化。

氮源對(duì)菌絲體生長和多糖產(chǎn)生也有重要影響。為了研究氮源對(duì)擬青霉菌的菌絲體生長和EPS產(chǎn)生的影響，0.5%的無機(jī)氮源和有機(jī)氮源分別加至無氮培養(yǎng)基。在本試驗(yàn)中，選取8種氮源，結(jié)果如圖4所示。

圖4　氮源對(duì)擬青霉菌菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4　The effect of different nitrogen source on mycelium growth and EPS production

如圖4所示，添加酵母膏的培養(yǎng)基產(chǎn)生的菌絲體最多（7.10 g/mL），EPS含量最高（0.46 g/mL），同時(shí)含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中的菌絲體產(chǎn)量明顯高于無機(jī)氮源的，主要是有機(jī)氮源不僅含有蛋白質(zhì)和氨基酸，而且含有其它生長因子等，有利于菌絲體的生長及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

2.3碳氮比的影響

為了研究碳氮比對(duì)擬青霉菌絲體生長和EPS生產(chǎn)的影響，改變葡萄糖濃度：10 g/L～60 g/L，固定酵母膏濃度，即改變不同的碳氮比（1∶1～6∶1），結(jié)果見表1。

如表1所示，碳氮比為1∶1～5∶1時(shí)適宜菌絲體生長和EPS產(chǎn)生，當(dāng)碳氮比為2∶1時(shí)，菌絲體和EPS產(chǎn)量最高。葡萄糖濃度較高時(shí)，供菌絲體生長和EPS產(chǎn)生的底物減少。

表1　碳氮比對(duì)菌絲體生物量和多糖的影響Table 1　Effects of C/N Ratio on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

2.4微量元素的影響

為了研究礦物質(zhì)和微量元素對(duì)菌絲體生長和EPS產(chǎn)生的影響，在培養(yǎng)基中添加1.0g/mL礦物質(zhì)和0.1g/mL的微量元素。對(duì)照組為僅含有10 g/mL葡萄糖、5 g/L酵母膏、不含有礦物質(zhì)和微量元素。添加0.5 g/mL KH2PO4，以適宜擬青霉菌絲體的生長和EPS的產(chǎn)生。報(bào)道稱PO43-參與多糖的生物合成，低濃度的礦物元素對(duì)生長效應(yīng)和EPS產(chǎn)生有重要影響。鐵離子是亞鐵紅素輔酶，參與電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。錳離子是超氧化物歧化酶的輔酶，而且對(duì)酶催化反應(yīng)很重要，尤其是針對(duì)應(yīng)用于ATP和合成DNA、RNA的酶。在真菌的液體培養(yǎng)基中，添加不同礦物質(zhì)可以促進(jìn)菌絲體的生長和EPS產(chǎn)生。本試驗(yàn)添加了0.1 g/mL CuCl2·2H2O，促進(jìn)了擬青霉菌EPS的產(chǎn)生。其結(jié)果如表2所示。

表2　微量元素對(duì)菌絲體生物量和多糖的影響Table 2　Effects of trace element on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

如表2所示，最佳組合為K2HPO4和MgSO4，這一結(jié)果與Ca2+的積累通過酶的作用抑制真菌的生物代謝物的合成理論一致。

2.5攪拌作用對(duì)菌絲體生長和EPS產(chǎn)生的影響

攪拌強(qiáng)弱對(duì)底物、加熱和溶解氧（DO）轉(zhuǎn)移都有重要影響。攪動(dòng)會(huì)產(chǎn)生剪切力，這會(huì)引起菌絲體形態(tài)學(xué)變化，溶解氧和剪切力對(duì)多糖產(chǎn)生有重要影響。本試驗(yàn)通過改變搖床攪拌速度，其它條件不變，測(cè)定發(fā)酵液中的多糖產(chǎn)率及菌絲體生物量，結(jié)果見表3。

表3　攪拌作用對(duì)菌絲體生物量和多糖的影響Table 3　Effects of agitation on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

由表3可見，當(dāng)攪拌速度最大時(shí)，葡萄糖消耗水平較高。當(dāng)攪拌速度為100 r/min時(shí)，由于相對(duì)傳質(zhì)較慢，殘余葡萄糖消耗緩慢。當(dāng)攪拌速度為400 r/min時(shí)，菌絲體含量最多（23.1 g/mL），EPS產(chǎn)量最高（2.51 g/mL）。關(guān)于擬青霉菌的攪拌促成的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和EPS，在低攪拌速度時(shí)可形成一簇菌絲體。當(dāng)攪拌速度較大，通風(fēng)好，底物濃度合適時(shí)，與自由菌絲體相比，菌絲體主要呈球狀。而且，擬青霉菌的球形菌絲體會(huì)影響EPS的產(chǎn)生。

2.6通風(fēng)對(duì)菌絲體生長和EPS產(chǎn)生的影響

通風(fēng)輔助次級(jí)代謝產(chǎn)物中底物、產(chǎn)物和氧的傳質(zhì)。因此，通風(fēng)強(qiáng)度是影響EPS產(chǎn)生的一項(xiàng)重要因素。在本研究中，其它發(fā)酵條件不變，只改變發(fā)酵時(shí)的通風(fēng)狀況，測(cè)定發(fā)酵后的多糖產(chǎn)率及菌絲體生物量，結(jié)果如表4。

表4　通風(fēng)對(duì)菌絲體生物量和多糖的影響Table 4　Effects of aeration on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

如表4可知，當(dāng)通風(fēng)1.0 vvm時(shí)，菌絲體數(shù)量達(dá)到最大（23.5 g/mL），EPS也達(dá)到最高（2.51 g/mL）。對(duì)于液體培養(yǎng)基中多種擔(dān)子菌產(chǎn)生EPS，前人也報(bào)道過類似結(jié)果［8-9］。

3　結(jié)論

綜上所述，為了得到最多的擬青霉菌EPS和菌絲體，本文研究了液體培養(yǎng)基的最優(yōu)培養(yǎng)條件和基質(zhì)組分。通過試驗(yàn)確定，最優(yōu)培養(yǎng)基為30 g/mL葡萄糖，20 g/mL酵母膏，0.5 g/mL KH2PO4和0.1 g/mL MgSO4· 7H2O。最適培養(yǎng)條件為溫度27℃、轉(zhuǎn)速400 r/min和通風(fēng)1.0 vvm，初始pH不受限制。采用最優(yōu)培養(yǎng)條件和調(diào)整后的培養(yǎng)介質(zhì)，5 L生物反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體生長最大可達(dá)23.5 g/mL，EPS最高可到2.51 g/mL。

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Research on Fermentation of Exo-polysaccharides from Paecilomyces japonica

ZHANG Qiang1，2，YE Ming2，*
（1.Life Sciences&Engineering College，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

The liquid culture conditions were optimized for maximal production of mycelial biomass and exopolysaccharide by Paecilomyces japonica.The effects of medium composition，C/N ratio and physical parameters were investigated.From these experiments，30 g/L glucose，20 g/L yeast extract，0.5 g/L KH2PO4，and 0.1 g/L MgSO4in distilled water were found to be the most suitable carbon，nitrogen，and mineral sources，respectively. The optimal temperature，initial pH，agitation，and aeration were determined to be 27℃，uncontrolled pH，400 r/min and for 7d，respectively.Under these optimal conditions，the maximum mycelial growth and polysaccharides production were 2.51 g/L and 23.5 g/L，respectively.

Paecilomycesjaponica；exo-polysaccharide；mycelialgrowth

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.033

張嬙（1980—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功效研究。

2015-08-26