許海峰，王 楠，姜生輝，王意程，劉靜軒，曲常志，王得云，左衛(wèi)芳，張 晶，冀曉昊，張宗營，毛志泉，陳學森

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

新疆紅肉蘋果雜種一代4個株系類黃酮含量及其合成相關基因表達分析

許海峰，王 楠，姜生輝，王意程，劉靜軒，曲常志，王得云，左衛(wèi)芳，張 晶，冀曉昊，張宗營，毛志泉，陳學森

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

【目的】研究新疆紅肉蘋果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck）Langenf.）與‘富士’（M. domestica cv. Fuji）等蘋果品種雜交后代株系間果實類黃酮合成差異的分子機理，為進一步完善功能型蘋果育種的理論與技術體系提供科學依據(jù)。【方法】以紫紅2號及紅脆1、2、4號等紅肉程度存在明顯差異的4個蘋果株系發(fā)育后期的果實為試材，進行MYB10啟動子基因型鑒定，并測定類黃酮組分和含量，分析類黃酮合成相關基因的表達?！窘Y果】紅脆1、2、4號MYB10啟動子基因型均是R6R1型，而紫紅2號啟動子類型為R6R6型。紅脆1號和紫紅2號果實成熟期類黃酮含量分別為3.0 mg·g-1和3.1 mg·g-1；紫紅2號花青苷含量（23.9 U·g-1FW）是紅脆1號（12.2 U·g-1FW）的2倍，其他類黃酮組分含量（1 635.3 mg·kg-1）僅是紅脆1號的69%。紫紅2號MYB10和UFGT等轉錄因子及花青苷合成基因在果實發(fā)育后期（花后110—125 d）均具有較高的表達量；紅脆4號的MYB10雖然在果實發(fā)育后期（花后110—125 d）表達量較高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT表達量較低。紅脆1、2、4號類黃酮組分含量分別為2 355.0、1 247.5和1 337.5 mg·kg-1，差異顯著；紅脆1號MYB12轉錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關結構基因表達量較高，而MYB16和MYB111表達量較低；紅脆2、4號MYB12轉錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關結構基因表達量較低，而MYB16和MYB111轉錄因子表達量較高?！窘Y論】MYB10、bHLH3和TTG1等轉錄因子及ANS和UFGT等花青苷生物合成結構基因在果實發(fā)育后期高水平表達，可能是導致紫紅2號成熟期果肉花青苷含量高的主要原因，而MYB12、MYB16和MYB111等轉錄因子及DFR、FLS、LAR和ANR類黃酮生物合成相關結構基因的差異表達，可能是導致紅脆1、2、4號等3個株系類黃酮組分及含量差異的主要原因。

新疆紅肉蘋果；雜交后代；類黃酮；MYB10 ；基因表達分析

0　引言

【研究意義】蘋果果實含有較高比例、人體比較容易吸收利用的游離多酚，營養(yǎng)保健價值高，在預防心腦血管疾病、抗腫瘤及抗氧化等方面有較好的作用，世界上許多國家都大力推薦其為主要消費果品［1-2］。中國是世界蘋果生產(chǎn)和消費大國，大多為‘富士’，且主要用于鮮食［3］。因此，圍繞新疆野蘋果及其紅肉變型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf.）等蘋果資源的科學保護與持續(xù)高效利用及栽培蘋果品種遺傳多樣性的拓展，開展功能型蘋果育種具有重要意義［4］?！厩叭搜芯窟M展】有關蘋果類黃酮及其代謝機理的研究在近幾年取得了較大的進展。已報道的蘋果果實類黃酮達34種，分屬黃烷醇、黃酮醇、二氫查爾酮、花青苷和二氫黃酮醇等5類［5］。有關蘋果類黃酮生物合成與調(diào)控機理的研究主要集中在花青苷上，目前已克隆、鑒定了CHS、ANS、UFGT等結構基因［6］；在蘋果轉錄因子方面，有研究發(fā)現(xiàn) MdMYB1和（MdMYBA）受光照誘導，能夠調(diào)控果皮花青苷的合成，并從蘋果中克隆鑒定了5個MdMYB1等位基因MdMYB1-1—5［7-9］；隨后，有研究表明MdMYB10轉錄因子能夠調(diào)控蘋果葉片和果肉的紅色發(fā)育，并且其調(diào)控活性需要轉錄因子MdbHLH3和MdbHLH33的參與［10-11］；AN等［12］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果 MdTTG1僅與bHLH蛋白存在直接相互作用，而無法與 MdMYB1發(fā)生互作。TELIAS等［13］研究表明，‘蜜脆’蘋果品種著色模式（條紅與暈紅）的可變性主要是由于MYB10啟動子區(qū)甲基化的不穩(wěn)定性；ESPLEY等［14］研究發(fā)現(xiàn)，紅肉蘋果品種‘Red Field’MdMYB10啟動子由于6個23 bp重復序列的插入，使得MdMYB10具有自激活特性和組成型表達，枝、葉、花及果實各部分均為紅色，并將這種含有6個重復序列的啟動子基因型命名為R6；而葉片和果心均為綠（白）色、僅果實外皮層組織為紅色的‘Sangrado’和‘jpp35’蘋果品種，則由MdMYB10同源基因MdMYB110a和MdMYB110a-jp調(diào)控其紅色部位花青苷的合成［15-16］，上述研究結果表明，不同蘋果品種的轉錄調(diào)控機理存在明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c】新疆野蘋果及其紅肉變型不僅是蘋果品質育種的重要基因庫，同時也是世界栽培蘋果的祖先種［17-18］。但新疆野蘋果資源正遭到嚴重破壞，瀕臨滅絕［19］；為此，筆者課題組在群體遺傳結構等相關研究的基礎上，于2006年率先構建了新疆紅肉蘋果與栽培蘋果品種的雜種分離群體［20-25］。張芮等［26］研究結果表明，雜種后代綿、脆肉株系果實質地發(fā)育受乙烯調(diào)控；JI等［27-28］探討了激素和氮對愈傷組織花青苷生物合成的影響，并對紅色和黃色愈傷組織進行了RNA-seq分析，而WANG等［29］則對F1分離群體中的紅色和綠色單株各20株進行了RNA-seq分析，篩選到了與類黃酮合成（圖 1）相關的差異表達基因，而有關紅肉株系間類黃酮差異和果肉著色的分子機理尚有待研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究以紫紅2號及紅脆1、2、4號等紅肉程度存在明顯差異的4個株系發(fā)育后期的果實為試材（圖2），進行MYB10啟動子類型鑒定，并測定類黃酮和組分含量及相關基因的相對表達量，旨在為進一步完善功能型蘋果育種的理論與技術體系提供參考。

圖1　蘋果類黃酮代謝途徑［30-31］Fig. 1 Metabolic pathway of flavonoid in apple［30-31］

圖2　4個蘋果株系成熟期截面圖Fig. 2 Sectional drawing of 4 apple strains in the mature period

1　材料與方法

試驗于 2012—2015年在山東農(nóng)業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室及泰安市橫嶺果樹育種基地進行。

1.1 植物材料及試劑

1.1.1 植物材料 從新疆紅肉蘋果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana）中的‘塔爾阿爾瑪’與‘煙富3號’（M. domestica cv. Fuji）雜種一代選育出紫紅2號及紅脆1、2、4號等紅肉程度存在明顯差異的4個株系，以其發(fā)育后期（近成熟期）的果實（圖 2）為試材，從果實近成熟期到果實完全成熟期，共采3次樣，分別為花后110、117和125 d。每次采樣均采10個果實，用液氮研磨成粉后，分裝成3份作為重復，在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑盒及菌株等 DNA提取試劑盒、RNA提

取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR染料、phusion高保真DNA擴增酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、零背景快速克隆試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞均購自天根生化科技北京有限公司，蘆丁標準品（rutin；Sigma chemical，St，Louis，USA，≥98%）。

1.2 試驗方法

1.2.1 MYB10啟動子基因型鑒定及序列分析基因的啟動子序列為2 000 bp左右，以NCBI中登錄號為 AB557643.1的序列為模板，設計上下游引物分別為F：5′-CAATGTGTTAGGTGTAGCGT-3′，R：5′-CAGAAGCAAACACTGACAAG-3′。以紅脆1、2、4號及紫紅2號果肉的DNA為模板，phusion高保真酶擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定MYB10啟動子類型，膠回收后，按照天根零背景快速克隆試劑盒做連接、轉化，搖菌活化涂板，挑取單克隆，菌液PCR鑒定選擇6個陽性克隆測序。測序后序列比對采用ClustalX2軟件［32］，每個克隆間測序結果一致。

1.2.2 花青苷含量的測定 參考馮守千等［33］的方法，取0.5 g克果肉液氮研磨成粉后，用10 mL 1%HCl/甲醇于4℃浸提4 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液用分光光度計測定提取液在553 nm和600 nm處吸光值。以每g果肉鮮質量的提取液的吸光度變化值D553-D600=0.01作為1個花青苷單位，以U表示。

1.2.3 類黃酮含量的測定 參考JIA［34］的方法，稱取1 g果肉，用液氮研磨成粉后，加入10 mL 65%預冷的乙醇，4℃避光浸提4 h，12 000 r/min離心 20 min，保留上清。吸取0.5 mL上清液于試管中，按順序分別加入 1 mL NaNO2（5%）、1 mL Al（NO3）3（10%），4 mL NaOH（2 mol·L-1），混勻靜置15 min，在510 nm下測定吸光值（以80%乙醇作為空白對照）。以蘆丁為標樣制作標準曲線，類黃酮含量表示為mg蘆丁·g-1FW。重復3次，操作步驟同上。

1.2.4 類黃酮組分的測定 參考陳學森等［4］的方法，去除果皮，稱取10 g用液氮研磨成粉的果肉，加入50 mL 0.5%鹽酸甲醇溶液，4℃浸提2 h，過濾，濾液4℃暫時避光保存，殘渣加入50 mL 0.5%鹽酸甲醇溶液，4℃浸提1 h，過濾，合并濾液后37℃旋蒸去除丙酮，殘留部分5 000 r/min離心，上清液用甲醇定溶至10 mL。取5 mL定容后的溶液，用購自Waters公司的C18Sep-Pak小柱進行純化［35］。進樣前，所有流動相和樣品均過0.22 μm的有機濾膜。

液相色譜條件：色譜儀（WATERS ACQUITY UPLC）采用BEH C18柱（100 mm×2.1 mm）為色譜柱，1.7 μm填料粒徑，柱溫45℃，進樣體積1 μL。流動相：已過濾的乙腈（A），體積分數(shù)為0.2%的甲酸溶液（B）；梯度：A：0—0.1 min 5%；A：20 min，20%；A：22 min，80%；A：22.1 min，5%；A：25 min，5%，流速為0.3 mL·min-1。350 nm下分析黃酮醇類物質，在280 nm下分析黃烷醇和二氫查爾酮類物質。為確定各類物質在紫外-可見光下的吸收特征，采用WATERS ACQUITY PDA檢測器，PAD掃描波長范圍200—700 nm。

1.2.5 實時熒光定量PCR 熒光定量PCR儀型號為伯樂 CFX96，熒光定量 PCR 反應體系按 SYBR? Green PCR Master Mix 說明書配制，每個樣品設3個重復。反應體系為20 μL：10 μL 2.5×RealMasterMix/ 20×SYBR Solution，1 μL cDNA（50 ng·μL-1），上下游引物各1 μL（5 μmol·L-1），7 μL ddH2O。反應條件如下：①95.0℃預變性30 s；②95.0℃變性5 s；③58℃退火10 s；④72.0℃延伸30 s（②—④共45個循環(huán)）；⑤65℃孵育20 s；⑥溶解溫度從55℃到95℃，每升高0.5℃保持1 s；⑦停止反應。以MdActin為內(nèi)參，每個基因擴增均有內(nèi)參同時擴增，默認條件下讀取Ct值，采用2-ΔΔCT方法［36］進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 熒光定量引物設計

CHI、F3H、DFR、ANR、UFGT、bHLH3、Actin熒光定量引物參考文獻［37］，MYB12熒光定量引物參考文獻［38］，F(xiàn)LS（AF119095）、LAR（AY830131）、ANS（DQ139835）、MYB10（EU518249.2）、TTG1 （GU173814.1）、MYB16（HM122617.1）、MYB111 （HM122615.1）利用Beacon Designer7（http：//www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/）設計熒光定量引物（表1）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)處理和作圖，用DPS 7.05軟件（http：//www.chinadps.net）進行顯著性檢驗。

2　結果

2.1 4個蘋果株系MYB10啟動子基因型鑒定

4個蘋果株系MYB10啟動子基因型鑒定結果見圖3、4、5、6。圖3（DNA Marker為天根D2000）顯示紅脆1、2、4號瓊脂糖凝膠電泳為兩條帶，紫紅2號為一條帶；圖4顯示紅脆1、2、4號和紫紅2號在 659—681 bp有一個 23 bp重復序列（GTTAGACTGGTAGCTATTAACAA）［14］，紫紅2號在520—630 bp比紅脆1、2、4號多5個重復序列；圖5顯示，紅脆1、2、4號R6與紫紅2號R6基本一致，均含有 6個重復序列。因此，根據(jù) R6型的序列（圖6），推測紅脆1、2、4號MYB10啟動子為R6R1型，而紫紅2號MYB10啟動子類型為R6R6型。

表1　蘋果類黃酮生物合成相關基因qPCR擴增引物序列Table 1 Primer sequence for qPCR amplification of flavonoids -biosynthesis genes in apple fruit

圖3　4個蘋果株系果實MYB10啟動子基因型鑒定Fig. 3 Genotype of MYB10 promoter in 4 apple strains

圖4　紅脆1、2、4號MYB10啟動子R1序列與紫紅2號R6序列比對結果Fig. 4 Sequence alignment consequence of MYB10 promoter in R1 of Hongcui NO.1、2、4 and R6 of Zihong NO. 2

2.2 4個蘋果株系果實發(fā)育后期類黃酮、類黃酮組分及花青苷含量

由圖7可以看出，在果實近成熟期（花后110—125 d），紅脆1號和紫紅2號果實類黃酮含量總體呈上升趨勢，其中成熟期（花后125 d），二者果實類黃酮含量分別為（3.0±0.16）mg·g-1和（3.1±0.18）mg·g-1；而紅脆2號和紅脆4號果實類黃酮含量總體呈下降趨勢，其中成熟期（花后125 d），二者果實類黃酮含量分別僅為（2.1±0.05）mg·g-1和（1.9±0.08）mg·g-1，紅脆1號和紫紅2號與紅脆2號和紅脆4號差異極顯著（P＜0.01）。由圖8可以看出，4個株系果實發(fā)育后期花青苷含量存在極顯著差異（P＜0.01），在成熟期紫紅2號最高（23.9±0.63 U·g-1FW），紅脆1號、紅脆4號和紅脆2號分別為（12.2±0.37）、（7.5±0.43）和（2.2±0.14）U·g-1FW。

圖5　紅脆1、2、4號MYB10啟動子R6序列與紫紅2號R6序列比對結果Fig. 5 Sequence alignment consequence of MYB10 promoter in R6 of Hongcui NO.1， 2， 4 and R6 of Zihong NO.2

圖6　R6型MYB10啟動子6個重復序列［14］Fig. 6 6 repeat sequences of R6 promoter in MYB10［14］

圖7　4個蘋果株系發(fā)育后期類黃酮含量變化Fig. 7 Change of flavonoid contents in 4 apple strains during the latter growth period

4個蘋果株系成熟期果實除花青苷之外的其他類黃酮組分及其含量的HPLC檢測結果見表2（合計為每個樣品每個重復值對應相加后的平均值）。由表2可以看出，4個功能型蘋株系成熟期果實類黃酮組分及其含量存在明顯差異，其中從紅脆1號成熟果實中檢測到黃烷醇、二氫查爾酮和黃酮醇等 3類11種組分，總含量高達（2 355.01±15.9）mg·kg-1，而紅脆 2號成熟果實中檢測到黃烷醇、二氫查爾酮和黃酮醇等3類8種組分，總含量僅為（1 247.4± 12.4）mg·kg-1。

圖8　4個蘋果株系發(fā)育后期花青苷含量變化Fig. 8 Change of anthocyanin contents in 4 apple strains during the latter growth period

表2　4個蘋果株系成熟期果肉類黃酮組分及其含量Table 2 Comparison in composition and content of flavonoid among 4 apple strain’s flesh in the mature period （mg·kg-1）

2.3 4個蘋果株系果實發(fā)育后期類黃酮生物合成相關結構基因和轉錄因子的表達分析

由圖9、10可以看出，紫紅2號MYB10、bHLH3、TTG1等轉錄因子及花青苷合成相關基因 ANS和UFGT在果實發(fā)育后期（花后110—125 d）均具有較高的表達量，而CHI、F3H、DFR、FLS、LAR等6個類黃酮生物合成相關結構基因表達量較低；紅脆4號的MYB10雖然在果實發(fā)育后期（花后110—125 d）表達量較高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT均表達量較低；紅脆1號MYB12轉錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關結構基因表達量較高，而MYB16和MYB111表達量較低；紅脆2、4號MYB12轉錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關結構基因表達量較低，而 MYB16和MYB111轉錄因子表達量較高。

圖9　4個蘋果株系果實發(fā)育后期相關結構基因表達量的變化Fig. 9 Changes of expression of structure-related genes in 4 functional apple strains during the latter period

圖10　4個蘋果株系果實發(fā)育后期相關轉錄因子基因表達量的變化Fig. 10 Changes of expression of transcription factors-related genes in 4 functional apple strains during the latter period

3　討論

3.1 蘋果果實花青苷合成差異及其與相關結構基因和轉錄因子的關系

花青苷與蘋果多種組織器官的呈色有關［39］，同時在人類醫(yī)療保健方面有重要的營養(yǎng)價值和藥理作用［40-41］?；ㄇ嘬蘸铣墒穷慄S酮合成途徑的一個分支，其合成代謝涉及多個結構基因、轉錄因子以及紫外輻射、干旱、低溫、茉莉酸、蔗糖、低氮等環(huán)境信號的誘導［42-43］。在蘋果花青苷合成途徑中，結構基因ANS和UFGT對蘋果花青苷的合成具有決定性作用［44-45］；在蘋果轉錄因子方面，MdMYB10能夠調(diào)控果肉的顏色，其調(diào)控活性需要轉錄因子 MdbHLH3 和MdbHLH33的參與，且MdMYB10具有自激活特性［10，14］；AN［12］及 BRUEGGEMANN［46］等研究發(fā)現(xiàn)，MYB、bHLH和WD40轉錄因子能夠形成MBW復合體促進花青苷的合成，但 MdTTG1僅與 bHLH類（MdbHLH3和MdbHLH33）轉錄因子相互作用，而無法與 MdMYB1發(fā)生互作。上述研究結果表明，MdMYB10（MdMYB1）、bHLH和MdTTG1是蘋果花青苷生物合成的主要轉錄調(diào)控因子。

在本研究中，從‘紅富士’（R1R1）等蘋果品種與新疆紅肉蘋果（R6R1）雜種一代群體選育的紫紅2號，MYB10啟動子基因型為R6R6型，在參試的4個株系中紅肉程度最大，果肉深紅色，成熟期果實花青苷含量（23.9 U·g-1FW）是紅脆1號（12.2 U·g-1FW）的2倍，MYB10、bHLH3、TTG1等轉錄因子及ANS 和UFGT等花青苷合成關鍵基因在果實發(fā)育后期（花后110—125 d）均具有較高的表達量；MYB10啟動子類型為R6R1型的紅脆4號，雖然在果實發(fā)育后期（花后110—125 d）MYB10表達量較高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT表達量較低。因此，其成熟期果實花青苷含量（7.5 U·g-1FW）僅是紫紅2號的31.4%。上述研究結果表明，MdMYB10、bHLH和MdTTG1是紫紅2號蘋果花青苷生物合成的關鍵轉錄調(diào)控因子，這與已有的研究結果一致。因此，進一步探討MdMYB10、bHLH和MdTTG1在調(diào)控紫紅2號蘋果花青苷生物合成進程中的互作關系是今后研究的重要切入點。

STEVEN等［47］對4個資源圃的3 000份紅肉蘋果種質資源進行了MYB10啟動子類型的鑒定和分類，其中包含了栽培種、野生種和雜交種，結果發(fā)現(xiàn)，幾個R6R1類型的果肉深紅，而R6R6類型的果肉卻只是輕微粉紅，表明 R6位點起作用也要取決于它們的遺傳背景，具體有待進一步研究。

3.2 蘋果果實類黃酮含量和組分差異及其與相關結構基因和轉錄因子的關系

已報道的蘋果果實類黃酮達34種，分屬黃烷醇、黃酮醇、二氫查爾酮、花青苷和二氫黃酮醇等5類［4］。張小燕等［20］研究發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果多酚物質含量的遺傳多樣性極為豐富，總酚及主要多酚物質含量顯著高于‘紅星’蘋果品種，表現(xiàn)出明顯的高黃酮特性。聶繼云等［48］研究發(fā)現(xiàn)，冬紅果和山荊子等 22種蘋果屬野生種質資源的果實總黃酮含量均明顯高于栽培品種。

除了花青苷之外，有關蘋果黃烷醇及黃酮醇生物合成及調(diào)控機理的研究報道相對較少。LIN-WANG等［49］將 MdMYB16和 MdMYB111轉入過表達 bHLH3+ MdMYB10的煙草葉片中，發(fā)現(xiàn)能夠抑制DFR啟動子的活性，認為MdMYB16和MdMYB111屬于蘋果類黃酮代謝途徑的負調(diào)控因子；周蘭等［38］在蘋果中克隆出與擬南芥 AtMYB12同源的 MdMYB12，其功能與AtMYB12相同，都能夠促進黃酮醇的合成，認為MdMYB12是蘋果類黃酮代謝途徑的正調(diào)控因子；AN等［50］發(fā)現(xiàn)，蘋果MdMYB9和MdMYB11能夠促進原花青素的合成；WANG等［29］則對新疆紅肉蘋果F1分離群體中的紅色和綠色單株各 20株進行了RNA-seq分析，篩選到了與類黃酮合成相關的差異表達基因，推測MdMYB12和MdMYB6可能參與了類黃酮代謝途徑。

在本研究中，紫紅2號和紅脆1號果實成熟期類黃酮含量相當，分別為3.0 mg·g-1和3.1 mg·g-1，但紫紅2號花青苷含量（23.9 U·g-1FW）是紅脆1號（12.2 U·g-1FW）的2倍，黃烷醇和黃酮醇等類黃酮組分含量（1 635.3 mg·kg-1）僅是紅脆1號（2 355.0 mg·kg-1）的69%，而紫紅2號FLS、LAR及ANR等類黃酮生物合成結構基因的低表達水平可能是其類黃酮組分含量低的主要原因；HAN等［51］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdANR在轉基因煙草中過表達，導致兒茶素和表兒茶素（黃烷醇）含量增加，而抑制了CHI和DFR的表達及花青苷的合成；因此，紫紅2號MYB10、bHLH3、TTG1等轉錄因子及ANS和UFGT等花青苷合成關鍵基因在果實發(fā)育后期的高水平表達，可能是FLS、LAR及ANR等類黃酮生物合成結構基因表達量低的主要原因，其調(diào)控關系有待進一步研究。

紅脆1、2、4號的MYB10啟動子基因型均為R6R1，類黃酮組分含量分別為 2 355.0 mg·kg-1、1 247.5 mg·kg-1和1 337.5 mg·kg-1，差異顯著；紅脆1號MYB12、CHI、F3H、DFR、FLS、LAR和ANR等轉錄因子及類黃酮生物合成相關結構基因表達量較高，而MYB16 和MYB111表達量較低；紅脆2、4號MYB12表達量較低，而MYB16和MYB111表達量較高。因此，MYB12、MYB16和MYB111等轉錄因子及DFR、FLS、LAR和ANR類黃酮生物合成相關結構基因的差異表達，可能是導致MYB10啟動子基因型均為R6R1型的紅脆1、2、4號等3個株系類黃酮及組分含量差異的主要原因。進一步探討MYB12、MYB16和MYB111等轉錄因子在功能型蘋果株（品）系類黃酮生物合成中的調(diào)控機理，是今后研究的重要切入點之一。

4　結論

紅脆1、2、4號的MYB10啟動子基因型均為R6R1，而紫紅2號MYB10啟動子類型為R6R6型。紫紅2號和紅脆1號果實成熟期類黃酮含量相當，但紫紅2號花青苷含量是紅脆1號的2倍。MYB10、bHLH3和TTG1等轉錄因子及ANS和UFGT等花青苷生物合成結構基因在果實發(fā)育后期的高水平表達，可能是導致紫紅 2號成熟期果肉花青苷含量高的主要原因；而MYB12、MYB16和MYB111等轉錄因子及DFR、FLS、LAR和 ANR類黃酮生物合成相關結構基因的差異表達，可能是導致MYB10啟動子基因型均為R6R1型紅脆1、2、4號等3個株系類黃酮及組分含量差異的主要原因。

References

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（責任編輯 趙伶俐）

Content and Analysis of Biosynthesis-Related Genes of Flavonoid Among Four Strains of Malus sieversii f. neidzwetzkyana F1Population

XU Hai-feng， WANG Nan， JIANG Sheng-hui， WANG Yi-cheng， LIU Jing-xuan， QU Chang-zhi， WANG De-yun，ZUO Wei-fang， ZHANG Jing， JI Xiao-hao， ZHANG Zong-ying， MAO Zhi-quan， CHEN Xue-sen
（College of Horticultural Science and Engineering， Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an 271018， Shandong）

【Objective】In order to develop the theory and breeding technology of functional apple， the molecular mechanism of the differences of flavonoid biosynthesis in several cross progenies of Malus sieversii f.neidzwetzkyana and M. domestica cv. Fuji was studied. 【Method】 Four apple stains （Zihong NO.2， Hongcui NO.1， Hongcui NO.2 and Hongcui NO.4） with significantdifference in red-flesh degree during the latter growth period were used as materials. The type of MYB10 promoter was identified，and the components and contents of flavonoids and the relative expressions of related genes were determined.【Result】The type of MYB10 promoter in Hongcui NO.1， Hongcui NO.2， and Hongcui NO.4 was R6R1， and that of Zihong NO.2 was R6R6. The contents of flavonoids in the mature period between Hongcui NO.1 （3.0 mg.g-1）and Zihong NO.2 （3.1 mg·g-1） were equivalent， while the anthocyanin content in Zihong NO.2 （23.9 U·g-1FW） was twice as that in Hongcui NO.1 （12.2 U·g-1FW）， and other contents of flavonoid of anthocyanin in Zihong NO.2 （1 635.3 mg·kg-1） was only 69% of that in Hongcui NO.1 （2 355.0 mg·kg-1）. The transcription factors and anthocyanin biosynthesis genes such as MYB10 and UFGT in Zihong NO.2 had higher expression during the latter growth period （110-125 d）. The expression of MYB10 in Hongcui NO.4 during the latter growth period （110-125 d） was higher，but the expression of bHLH3， TTG1， ANS and UFGT were lower. The contents of flavonoid components among Hongcui NO.1 （2 355.0 mg·kg-1）， Hongcui NO.2 （1 247.5 mg·kg-1） and Hongcui NO.4 （1 337.5 mg·kg-1） indicated significant differences. In Hongcui NO.1， the MYB12， FLS， LAR and ANR showed higher expression， while the expression of MYB16 and MYB111 were lower. The MYB12， FLS， LAR and ANR in Hongcui NO.2 and Hongcui NO.4 showed lower expression， while the expression of MYB16 and MYB111 were higher.【Conclusion】The transcription factors， such as MYB10， BHLH3， TTG1， and the structure genes which were associated with anthocyanin biosynthesis including ANS， UFGT were obviously up-regulated during the latter growth period， and it might be the main reason that caused high anthocyanin content in Zihong NO.2 flesh in the mature period. Meanwhile， the transcription factors， for example， MYB12， MYB16， MYB111， and the structure genes that relative to flavonoid biosynthesis such as DFR， FLS， LAR， ANR had different expressions， and it might be the main reason that led to the difference in the components and contents of flavonoid among the 3 strains of Hongcui NO.1， Hongcui NO.2 and Hongcui NO.4.

M.sieversii f. neidzwetzkyana； cross progeny； flavonoid； MYB10； gene expression analysis

2016-01-31；接受日期：2016-04-15

國家自然科學基金（31572091）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303093）、山東省水果創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-03-022-01）

聯(lián)系方式：許海峰，E-mail：997524744@qq.com。通信作者陳學森，E-mail：chenxs@sdau.edu.cn