吳 彤，劉 旭，李佳禾，閆新博，張 寧，吳文學(xué)

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

牛支原體等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒研究

吳 彤1，劉 旭2，李佳禾2，閆新博2，張 寧2，吳文學(xué)2

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

【目的】牛支原體（Mycoplasma bovis）是導(dǎo)致牛多種疾病綜合征的病原體之一，在世界范圍廣泛流行。為了有效監(jiān)測(cè)此病在中國的流行情況，迫切需要敏感、便捷的診斷試劑產(chǎn)品?！痉椒ā客ㄟ^構(gòu)建含有牛支原體uvrC基因片段的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組大腸桿菌rP-uvrC。重組大腸桿菌大量表達(dá)并提取重組質(zhì)粒后，獲得質(zhì)粒濃度為104拷貝/μL的溶液，作為質(zhì)控用陽性對(duì)照品。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的濃度配制甜菜堿溶液和顯色液（主成份為SYBR Green I和HNB），分別作為凍干品溶解用溶液和等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物顯色溶液。在已建立的牛支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上配制等溫?cái)U(kuò)增試劑，并通過考察等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)情況在常用的8種凍干疫苗耐熱保護(hù)劑中選擇對(duì)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)沒有影響的3種凍干保護(hù)劑，每種保護(hù)劑分別選用3種不同的濃度，共設(shè)計(jì)27種保護(hù)劑組方，通過觀察凍干品物理性狀選擇最佳的一組保護(hù)劑配制凍干用等溫?cái)U(kuò)增試劑，放到凍干機(jī)中測(cè)定共晶點(diǎn)，并優(yōu)化一次干燥升溫時(shí)間、干燥時(shí)間和二次干燥時(shí)間。通過對(duì)凍干制品物理性狀的檢驗(yàn)、真空度的檢測(cè)以及殘余水分含量的測(cè)定，篩選出一條適合等溫?cái)U(kuò)增試劑的凍干曲線，并以此制備等溫?cái)U(kuò)增試劑凍干品。取一定量等溫?cái)U(kuò)增試劑凍干品、甜菜堿溶液、陽性對(duì)照品溶液和顯色液，組裝成試劑盒。利用6個(gè)濃度梯度（100—105個(gè)拷貝）重組質(zhì)粒溶液檢測(cè)試劑盒的敏感性，利用濃度為104CCU·mL-1的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原體菌液、108CCU·mL-1的牛鼻支原體和無乳支原體菌液、108CFU·mL-1的多殺性巴氏桿菌和結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)試劑盒的特異性。另外，將等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒分別置于不同溫度下保存，檢測(cè)其穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】8種凍干保護(hù)劑中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白不影響等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上優(yōu)選的凍干保護(hù)劑配方為 5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白，等溫?cái)U(kuò)增試劑共晶點(diǎn)為-16℃，一次干燥的升溫時(shí)間3 h，一次干燥時(shí)間6 h，二次干燥時(shí)間4 h。組裝后的試劑盒最低可檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒，檢驗(yàn)PG45株、HB-1株以及SD-2株牛支原體均為陽性，檢驗(yàn)牛鼻支原體、無乳支原體、多殺性巴氏桿菌和結(jié)核分枝桿菌均為陰性。試劑盒在20℃保存6個(gè)月、37℃保存10 d后，敏感性仍為10個(gè)拷貝數(shù)，與第0 天相同，推測(cè)4℃保存有效期為24個(gè)月左右。【結(jié)論】筆者研制的等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒敏感性高、特異性好、穩(wěn)定性好、操作便捷，適合基層獸醫(yī)現(xiàn)場檢測(cè)使用。

牛支原體；等溫?cái)U(kuò)增；凍干；試劑盒；RT-PCR

0　引言

【研究意義】牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種感染牛的致病性病原體，可導(dǎo)致牛肺炎、乳腺炎等多種疾病，在世界范圍內(nèi)普遍存在［1-3］。自2008年以來，中國部分地區(qū)暴發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，病死率高達(dá)10%—50%，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4-8］。病原分離和鑒定是診斷牛支原體病的經(jīng)典方法，然而由于牛支原體生長緩慢，從臨床樣本中初次分離一般需要盲傳 2—4代才能通過顯微鏡在固體培養(yǎng)基上看到菌落，需要數(shù)日才能得到檢測(cè)結(jié)果，不僅檢出率低，而且檢測(cè)工作耗時(shí)、耗力。因此，研究建立更加敏感、快捷的診斷方法具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】BALL等報(bào)道了一種基于單克隆抗體的夾心ELISA方法，用以檢測(cè)肺組織、鼻拭子以及奶樣中的牛支原體病原，但與Real- Time PCR相比，夾心ELISA敏感性較低［9-12］。還有基于單克隆抗體建立的免疫組化方法，用于檢測(cè)福爾馬林固定組織中牛支原體［13-14］。HIGUCHI等建立了一種簡單 PCR方法，可以直接檢測(cè)奶樣中的 M. bovis、M. arginini、M. bovigenitalium、M. californicum、M. bovirhinis、M. alkalescens和M. canadense而不需要DNA提取，最低檢測(cè)濃度為2.5×103CFU·mL-1，與標(biāo)準(zhǔn)PCR方法相同［15］。CREMONESI P等建立的DNA提取和PCR檢測(cè)方法最低可檢測(cè)奶和生理鹽水10 CFU·mL-1牛支原體或0.25 pg 牛支原體DNA［16］。ROSSETTI等建立了Real-Time PCR方法，對(duì)牛支原體的檢測(cè)限為2.0×103CFU·mL-1，與細(xì)菌培養(yǎng)方法相同［17］。SACHSE等通過在Real-Time PCR反應(yīng)體系中加入牛支原體種特異性探針的方法，不僅敏感性提高到100 CFU·mL-1，而且特異性好［18］。BEN等建立了一種新的 TaqMan單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide-polymorphism，SNP）Real-Time PCR方法，檢測(cè)限可以達(dá)到5 fg DNA（約相當(dāng)于5個(gè)牛支體基因組）［19］。上述核酸擴(kuò)增方法雖然具有敏感性高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)操作人員的技術(shù)水平和儀器設(shè)備要求較高，很難在基層推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop- mediated isothermal amplification， LAMP）只在恒溫條件下反應(yīng)1 h就可以完成，而且敏感性高，特異性強(qiáng)，已廣泛用于多種病原的檢測(cè)［20-21］。劉旭等建立的牛支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的敏感性達(dá)到 20 pg，且特異性好［22］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】牛支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法敏感性高，特異性好，而且對(duì)儀器和操作人員的技術(shù)水平要求較低，非常適合在基層推廣應(yīng)用。然而，由于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的酶等成分容易降解，不利于長期保存和運(yùn)輸。在疫苗研制過程中，為了便于貯存和冷鏈運(yùn)輸，通常會(huì)通過冷凍干燥的方法制備凍干疫苗，這項(xiàng)技術(shù)和工藝已經(jīng)非常成熟，如果能將等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑進(jìn)行凍干，則有利于等溫?cái)U(kuò)增試劑的保存和運(yùn)輸?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選對(duì)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)沒有影響的凍干保護(hù)劑，設(shè)計(jì)并篩選最佳的保護(hù)劑配方，優(yōu)化凍干工藝，對(duì)等溫?cái)U(kuò)增試劑進(jìn)行凍干，通過敏感性、特異性和穩(wěn)定性試驗(yàn)檢驗(yàn)凍干品的質(zhì)量，最終研制成功牛支原體等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒。

1　材料與方法

1.1 病原與培養(yǎng)條件

牛支原體PG45株（ATCC）、牛支原體HB-1株（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病快速診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存）、牛支原體 SD-2株（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病快速診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存）、牛鼻支原體（ATCC）和無乳支原體（ATCC），均接種于含有2.5%酵母粉和20%馬血清的類胸膜肺炎微生物肉湯培養(yǎng)基（PPLO）中，在含有5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)；多殺性巴氏桿菌931株（CVCC），接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)；牛結(jié)核桿菌菌液，周向梅贈(zèng)送。

1.2 陽性對(duì)照品的制備

為了制備敏感性參比品，利用pEASY T1 Simple載體（購自全式金生物技術(shù)有限公司）構(gòu)建含牛支原體的保守性u(píng)vrC基因片段的重組質(zhì)粒，利用引物F：5′-GAATTTACGCAAGAGAATGCTTCA-3′； R： 5′-TC AGGCCTTTGCTACAATGAAC-3′ 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段長度1 778 bp。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃4 min；變性94℃ 30 s，退火51℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 10 min［23］。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化，連接pEASY T1 Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞（購自全式金生物技術(shù)有限公司），獲得重組大腸桿菌rP-uvrC。取重組大腸桿菌rP-uvrC，按10%比例接種LBAmp+液體培養(yǎng)基，混合均勻后置37℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)16 h后，菌液5 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用Easy Pure Mini Plasmid Purification Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：EM101-01）提取和純化重組質(zhì)粒，經(jīng)過0.22 μmol·L-1

濾器過濾除菌，用微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，用雙蒸水將重組質(zhì)粒溶液稀釋到104拷貝/μL，分裝至凍存管中，0.1 mL/管，作為質(zhì)控用陽性對(duì)照品，4℃保存。

1.4 甜菜堿溶液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的反應(yīng)體系中甜菜堿濃度［22］，取甜菜堿15.0 g置于50 mL容量瓶中，加入雙蒸水溶解并定容至50 mL，經(jīng)過0.22 μmol·L-1濾器過濾除菌，分裝至凍存管中，0.4 mL/管，4℃保存。

1.5 顯色液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的顯色液組成配比［24］，用雙蒸水將SYBR Green I（10 000×）稀釋為800×的溶液5 mL，用雙蒸水將HNB粉末溶解并稀釋至1.5 mmol·L-1的溶液5 mL。將稀釋好的SYBR Green I和HNB以1∶1的體積比混合，經(jīng)過0.22 μmol·L-1濾器過濾除菌，分裝至棕色凍存管中，0.06 mL/管，4℃避光保存。

1.6 等溫?cái)U(kuò)增試劑凍干品的制備

1.6.1 凍干保護(hù)劑的初步篩選 參考文獻(xiàn)［22］報(bào)道方法配制等溫?cái)U(kuò)增試劑。選取常用的凍干疫苗耐熱保護(hù)劑如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、牛血清白蛋白、酪蛋白和水解乳蛋白，作為等溫?cái)U(kuò)增試劑的耐熱凍干保護(hù)劑原料。向等溫?cái)U(kuò)增試劑中分別加入上述保護(hù)劑，其中海藻糖的濃度為10%（質(zhì)量體積比，w/v），其他物質(zhì)的濃度均為5%（質(zhì)量體積比，w/v），以不添加任何保護(hù)劑的等溫?cái)U(kuò)增試劑作為對(duì)照。-40℃冷凍4 h后，置室溫溶解，加入濃度為104拷貝/μL的陽性對(duì)照品，恒溫儀中63℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并據(jù)此篩選對(duì)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)沒有影響的凍干保護(hù)劑。

1.6.2 保護(hù)劑的優(yōu)化 選擇對(duì)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的敏感性沒有影響的3種物質(zhì)即海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白，作為保護(hù)劑。每種物質(zhì)選擇3種不同的濃度，即海藻糖（等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的10%、5%、2.5% w/v）、甘露醇和牛血清白蛋白（等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的 5%、2.5%、1.25% w/v），設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，共有27種保護(hù)劑組方。將配制好的含有凍干保護(hù)劑的等溫?cái)U(kuò)增試劑（不含甜菜堿）進(jìn)行無菌分裝，每個(gè)西林瓶中加入500μL反應(yīng)液（相當(dāng)于25個(gè)反應(yīng)體系）。分裝后，將27種不同組方的等溫?cái)U(kuò)增試劑置于Christ凍干機(jī)內(nèi)，按照凍干疫苗的凍干曲線（圖 1）進(jìn)行冷凍干燥，并通過觀察凍干品形態(tài)選擇最佳的一組保護(hù)劑。

圖1　普遍采用的疫苗凍干曲線Fig. 1 The lyophilizing curve generally used for preparation of vaccines

1.6.3 凍干曲線的優(yōu)化

（1）等溫?cái)U(kuò)增試劑共晶點(diǎn)的測(cè)定 按最佳的凍干保護(hù)劑組方配制等溫?cái)U(kuò)增試劑，加至西林瓶中。再將共晶點(diǎn)測(cè)試探頭伸入西林瓶中的液面下，通過記錄軟件可以記錄等溫?cái)U(kuò)增試劑由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)過程中電阻率的變化。等溫?cái)U(kuò)增試劑的溫度曲線和電阻率曲線的交叉點(diǎn)即為等溫?cái)U(kuò)增試劑的共晶點(diǎn)。

（2）凍干曲線的優(yōu)化 以篩選出的最佳的一組凍干保護(hù)劑的配方為基礎(chǔ)，根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增試劑的共晶點(diǎn)調(diào)整凍干曲線，主要針對(duì)一次干燥過程中的升溫時(shí)間、干燥時(shí)間和二次干燥中的干燥時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。通過對(duì)凍干制品的物理性狀的檢驗(yàn)、真空度的檢測(cè)以及殘余水分含量的測(cè)定，篩選出一條適合等溫?cái)U(kuò)增試劑的凍干曲線。

1.6.4 等溫?cái)U(kuò)增試劑的凍干 配制等溫?cái)U(kuò)增試劑后加至西林瓶中，每個(gè)西林瓶500 μL（相當(dāng)于25個(gè)反應(yīng)體系），放入凍干機(jī)內(nèi)，根據(jù)1.6.3優(yōu)化的凍干曲線進(jìn)行凍干。

1.7 等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的組裝與使用方法

等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒主要包括等溫?cái)U(kuò)增試劑凍干品、甜菜堿溶液、陽性對(duì)照品溶液和顯色液。用時(shí)將甜菜堿溶液加入等溫?cái)U(kuò)增混合物凍干品中溶解，加至PCR反應(yīng)管中，每管20 μL。向各PCR管中加入樣品液或陽性對(duì)照品，同時(shí)用純凈水做陰性對(duì)照，將顯色液加至PCR管蓋內(nèi)側(cè)，封蓋，置（63±1）℃反應(yīng)45 min，顛倒PCR管使顯色劑與反應(yīng)液充分混合，觀察混合液顏色變化，陽性對(duì)照品為綠色，陰性對(duì)照品為褐色。

1.8 敏感性檢驗(yàn)

利用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，通過微量分光光度計(jì)（Nanodrop）測(cè)定質(zhì)粒濃度，進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋，按100—105個(gè)拷貝濃度加至等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中，用等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過顏色變化和瓊脂凝膠電泳方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 特異性檢驗(yàn)

取牛支原體PG-45株、HB-1株以及SD-2株菌液，活菌計(jì)數(shù)后用無菌水稀釋至104CCU·mL-1。同時(shí)，取牛鼻支原體菌（108CCU·mL-1）、無乳支原體菌液（108CCU·mL-1）、多殺性巴氏桿菌（108CFU·mL-1）、結(jié)核分枝桿菌（108CFU·mL-1），置水浴中煮沸10 min后冷卻，同時(shí)用等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，通過顏色變化或瓊脂凝膠電泳方法判斷陰陽性。

1.10 保存期試驗(yàn)

將等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒分別置于20℃和37℃保存，定期取試劑盒進(jìn)行敏感性檢測(cè)，考察不同條件保存后的敏感性。

2　結(jié)果

圖2　凍干保護(hù)劑的初步篩選Fig. 2 Selection of the freeze-drying protective agent

2.1 凍干保護(hù)劑的初步篩選

保護(hù)劑的初步篩選結(jié)果表明，只有添加 10%w/v海藻糖、5%w/v甘露醇或牛血清白蛋白的等溫?cái)U(kuò)增試劑能進(jìn)行正常的擴(kuò)增反應(yīng)（圖 2），其它保護(hù)劑均會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。

2.2 等溫?cái)U(kuò)增試劑共晶點(diǎn)的測(cè)定

將測(cè)試探頭置于反應(yīng)液液面以下，即可在凍干過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)液的電阻率，當(dāng)反應(yīng)液由液態(tài)逐漸變成固態(tài)時(shí)，其電阻率會(huì)增加。等溫?cái)U(kuò)增試劑的溫度曲線（圖3中藍(lán)色曲線）和電阻率曲線（圖3中紫色曲線）的交點(diǎn)就是其共晶點(diǎn)。凍干保護(hù)劑配方為 5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白的等溫?cái)U(kuò)增試劑共晶點(diǎn)為-16℃。

圖3　等溫?cái)U(kuò)增試劑共晶點(diǎn)的測(cè)定Fig. 3 The eutectic point of the isothermal amplification reagent

2.3 凍干曲線的優(yōu)化

一次干燥的升溫時(shí)間、干燥時(shí)間以及二次干燥的干燥時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果分別見表1、表2和表3。一次干燥的升溫時(shí)間選擇2 h和3 h進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，升溫時(shí)間為2 h時(shí)，雖然制品的外觀性狀較好，但是通過敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凍干制品的敏感性下降，說明可能是由于升溫速度過快，導(dǎo)致Bst DNA聚合酶失活較多；選擇3 h時(shí)，凍干制品的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的敏感性未發(fā)生變化，故選擇3 h作為一次干燥的升溫時(shí)間。

由表2可知，一次干燥的干燥時(shí)間為24和12 h時(shí)，由于干燥時(shí)間過長，導(dǎo)致制品表面形態(tài)較差，而干燥時(shí)間為3 h時(shí)，制品的水分含量過高，說明干燥時(shí)間過短。由此，選擇6 h為一次干燥的干燥時(shí)間。

表1　一次干燥不同升溫時(shí)間獲得的凍干品的物理性狀Table 1 The heating-up times and the physical characters of the freeze-dried products during the first drying process

表2　一次干燥的干燥時(shí)間的優(yōu)化Table 2 Optimization of the drying time during the first drying process

由表3可知，二次干燥的干燥時(shí)間為8 h時(shí)，凍干制品的表面出現(xiàn)皸裂，說明干燥時(shí)間過長；而干燥時(shí)間為2 h時(shí)，制品在常溫下出現(xiàn)萎縮，說明制品的含水量較高，應(yīng)該延長干燥時(shí)間。因此，選擇4 h作為二次干燥的干燥時(shí)間。

將上述3個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化后，得到一條適用于等溫?cái)U(kuò)增試劑的凍干曲線（圖 4），凍干的總時(shí)間縮短了一倍左右。

圖4　優(yōu)化后的等溫?cái)U(kuò)增試劑的凍干曲線Fig. 4 Optimized lyophilizing curve of the isothermal amplification reagent

表3　二次干燥的干燥時(shí)間的優(yōu)化Table 3 Optimization of the drying time during the second drying process

2.4 等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的敏感性檢測(cè)

以不同濃度梯度的質(zhì)粒P-uvrC為模板，利用等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒檢測(cè)敏感性，顯色與凝膠電泳結(jié)果均表明，等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒最低可檢測(cè)到10個(gè)拷貝的質(zhì)粒（圖5）。

2.5 等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的特異性檢測(cè)

陰性對(duì)照顯褐色且無條帶，陽性對(duì)照顯綠色且有典型條帶，證明對(duì)照成立。牛支原體PG45株、HB-1株以及 SD-2株經(jīng)等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒檢測(cè)，均顯綠色和典型的梯形條帶，判定為陽性；牛鼻支原體、無乳支原體、多殺巴氏桿菌和結(jié)核桿菌經(jīng)試劑盒檢測(cè)，均顯褐色且無典型條帶，判定為陰性（圖6）。

2.6 等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒的保存期試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒在20℃保存6個(gè)月后敏感性為10拷貝，在37℃保存10 d后敏感性也為10拷貝，且均與第0 天結(jié)果相同，由此說明，在這兩種條件下試劑盒敏感性并未降低，質(zhì)量穩(wěn)定。

圖5　等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒敏感性檢測(cè)Fig.5 Sensitivity test of the freeze-dried kit

圖6　等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒特異性檢驗(yàn)Fig. 6 Specificity test results of the freeze-dried kit

圖7　凍干試劑盒不同保存條件下敏感性試驗(yàn)Fig. 7 Specificity test results of the freeze-dried kit stored under different conditions

3　討論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)自2003年用于細(xì)菌檢測(cè)以來，在動(dòng)物傳染病病原檢測(cè)方面得到了廣泛研究和應(yīng)用［25］。如FUKUTA用LAMP檢測(cè)番茄斑萎病毒的敏感性比PCR高100倍［26］。KUBOKI建立的非洲錐蟲LAMP檢測(cè)方法，不僅可以區(qū)分布氏錐蟲的4個(gè)亞種，而且敏感性也較高［27］。 張躍偉建立的以HNB為終產(chǎn)物顯色劑的 RT-LAMP方法最低可檢測(cè)103拷貝高致病豬繁殖與呼吸綜合征病毒，并具有很好的特異性［28］。蔣菲建立的以鈣黃綠素與 Mn2+混合溶液為終產(chǎn)物顯色劑的 RT-LAMP方法最低可檢測(cè)103拷貝H9亞型禽流感病毒，較 RT-PCR 方法的敏感性高10倍，且通過對(duì)15種H亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)表明該方法具有良好的特異性［29］。李佳禾建立的 LAMP最低可檢測(cè)到102拷貝的豬胸膜肺炎放線桿菌，敏感性是PCR方法的10倍，并通過對(duì)1—10型豬胸膜肺炎放線桿菌和其它18種病原微生物的檢測(cè)證明有很好的種特異性，對(duì)127份臨床發(fā)病豬的鼻拭子的檢出率為 100%；以SYBR Green I與 HNB的混合液為終產(chǎn)物顯色劑的LAMP方法最低可檢測(cè)102拷貝豬肺炎支原體，并通過42株豬肺炎支原體和27種其它病原證明該方法有很好的敏感性和特異性［24，30］。本研究表明，筆者研制的等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒與 RT-PCR方法的敏感性相同，均能檢出最低10個(gè)拷貝數(shù)的含牛支原體目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒，并具有很好的敏感性和特異性。為方便結(jié)果判定，本研究采用了SYBR Green I與HNB混合液作為顯色劑，結(jié)果表明陰陽性顏色對(duì)比明顯，并與瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)一致。由此說明，試劑盒采用顯色法檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

冷凍干燥技術(shù)是提高生物制品穩(wěn)定性的通用方法，也為分子診斷試劑的長期保存提供了有效途徑。例如，KLATSER等通過在PCR反應(yīng)試劑中加入5%海藻糖并凍干的方法，使反應(yīng)試劑在4℃和20℃的條件下可存放一年，甚至在37℃也可以保存3個(gè)月之久［31］。李美霞等通過在 LAMP反應(yīng)試劑中加入15%海藻糖并凍干的辦法，使 LAMP反應(yīng)試劑在25℃下的有效期由12 d延長到至少3個(gè)月［32］。為了篩選等溫?cái)U(kuò)增試劑凍干用的保護(hù)劑，筆者先將添加有不同保護(hù)劑的等溫?cái)U(kuò)增試劑放置在-40℃凍存 4 h，取出溶化后，檢測(cè)不同濃度陽性質(zhì)粒溶液，并與不加保護(hù)劑的等溫?cái)U(kuò)增試劑進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)敏感性沒有影響。商品化的Bst酶溶液中甘油占50%［33］，甘油是一種有機(jī)溶劑，添加量高時(shí)會(huì)使等溫?cái)U(kuò)增試劑很難凍結(jié)，干燥階段樣品出現(xiàn)鼓泡溶化，無法成型。為此，筆者選用高濃度Super Bst DNA聚合酶，將等溫?cái)U(kuò)增試劑中Bst酶溶液的添加體積減少15倍左右，減少了甘油對(duì)凍干的影響。按此方法配制的等溫?cái)U(kuò)增試劑在優(yōu)化條件下凍干，得到了質(zhì)量較好的凍干品。各種試驗(yàn)結(jié)果也表明，組裝的等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒具有很好的敏感性和特異性，在20℃下可保存至少6個(gè)月，在37℃至少可保存10 d，據(jù)此推測(cè)牛支原體等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒在2—8℃下可穩(wěn)定保存24個(gè)月左右。

4　結(jié)論

綜上所述，牛支原體等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑優(yōu)選的凍干保護(hù)劑配方為5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白，共晶點(diǎn)為-16℃，一次干燥的升溫時(shí)間3 h，一次干燥時(shí)間6 h，二次干燥時(shí)間4 h。制備的牛支原體等溫?cái)U(kuò)增凍干試劑盒敏感性高、特異性好，2—8℃保存期可達(dá)24個(gè)月，而且操作簡便，非常適合于臨床快速檢測(cè)，具有很好的應(yīng)用前景。

References

［1］ NICHOLAS R A， AYLING R D. Mycoplasma bovis： disease，diagnosis， and control. Research in Veterinary Science， 2003， 74（2）：105-112.

［2］ MAUNSELL F P， WOOLUMS AR， FRANCOZ D， ROSENBUSCH R F， STEP D L， WILSON D J， JANZEN E D. Mycoplasma bovis infections in cattle. Journal of Veterinary Internal Medicine， 2001，25：772-783.

［3］ ADAMU J Y， WAWEGAMA N K， BROWNING， G F， MARKHAM，P F. Membrane proteins of Mycoplasma bovis and their role in pathogenesis. Research in Veterinary Science， 2013， 95：321-325.

［4］ 胡長敏， 石磊， 龔瑞， 白智迪， 郭愛珍. 牛支原體病研究進(jìn)展. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2009， 30（8）： 73-77.HU C M， SHI L， GONG R， BAI Z D， GUO A Z. Progress on Bovine Mycoplasmosis.Progress in Veterinary Medicine， 2009， 30（8）：73-77. （in Chinese）

［5］ HAINES D M， MARTIN K M， CLARK E G， JIM G K， JANZEN E D. The immunohistochemical detection of Mycoplasma bovis and bovine viral diarrhea virus in tissues of feedlot cattle with chronic，unresponsive respiratory disease and/or arthritis. The Canadian Veterinary Journal， 2001， 42： 857-860.

［6］ SHAHRIAR F M， CLARK E G， JANZEN E， WEST K， WOBESER G.

Coinfection with bovine viral diarrhea virus and Mycoplasma bovis in feedlot cattle with chronic pneumonia. The Canadian Veterinary Journal， 2002， 43： 863-868.

［7］ GAGEA M I， BATEMAN K G， VAN DREUMEL T， MCEWEN B J，CARMAN S， ARCHAMBAULT M， SHANAHAN， R A， CASWELL J L. Diseases and pathogens associated with mortality in Ontario beef feedlots. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation， 2006， 18：18-28.

［8］ NICHOLAS R A. Bovine mycoplasmosis： silent and deadly. The Veterinary Record， 2011， 168： 459-462.

［9］ BALL H J， FINLAY D， REILLY G A. Sandwich ELISA detection of Mycoplasma bovis in pneumonic calf lungs and nasal swabs. The Veterinary Record， 1994， 135（22）：531-532.

［10］ BLACKBURN P， BROOKS C， BALL H J. Filtration of homogenised tissue samples to improve the diagnostic detection of Mycoplasma bovis by sandwich ELISA. The Veterinary Record， 2008， 163（17）：514-515.

［11］ HELLER M， BERTHOLD E， PFüTZNER H， LEIRER R， SACHSE K. Antigen capture ELISA using a monoclonal antibody for the detection of Mycoplasma bovis in milk. Veterinary of Microbiology，1993， 37（1-2）：127-133.

［12］ BELL C J， BLACKBURN P， PATTERSON I A， ELLISON S， BALL H J. Real-time PCR demonstrates a higher prevalence of Mycoplasma bovis in Northern Ireland compared with sandwich ELISA. The Veterinary Record， 2012， 171（16）：402.

［13］ HERMEYER K， JACOBSEN B， SPERGSER J， ROSENGARTEN R，HEWICKER-TRAUTWEIN M. Detection of Mycoplasma bovis by in-situ hybridization and expression of inducible nitric oxide synthase，nitrotyrosine and manganese superoxide dismutase in the lungs of experimentally-infected calves. Journal of Comparative Pathology，2011， 145（2-3）：240-250.

［14］ ADEGBOYE D S， RASBERRY U， HALBUR P G， ANDREWS J J，ROSENBUSCH R F. Monoclonal antibody-based immunohistochemical technique for the detection of Mycoplasma bovis in formalin-fixed，paraffin-embedded calf lung tissues. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation， 1995， 7（2）：261-265.

［15］ HIGUCHI H， IWANO H， KAWAI K， OHTA T， OBAYASHI T，HIROSE K， ITO N， YOKOTA H， TAMURA Y， NAGAHATA H. A simplified PCR assay for fast and easy mycoplasma mastitis screening in dairy cattle. Journal of Veterinary Science， 2011， 12（2）：191-193.

［16］ CREMONESI P， VIMERCATI C， PISONI G， PEREZ G， RIBERA AM，CASTIGLIONI B， LUZZANA M， RUFFO G， MORONI P. Development of DNA extraction and PCR amplification protocols for detection of Mycoplasma bovis directly from milk samples， VeterinaryResearch Communications， 2007， 31（Suppl 1）：225-227.

［17］ ROSSETTI B C， FREY J， PILO P. Direct detection of Mycoplasma bovis in milk and tissue samples by real-time PCR. Molecular and Cellular Probes， 2010， 24（5）：321-323.

［18］ SACHSE K， SALAM HS， DILLER R， SCHUBERT E， HOFFMANN B， HOTZEL H. Use of a novel real-time PCR technique to monitor and quantitate Mycoplasma bovis infection in cattle herds with mastitis and respiratory disease， The Veterinary Journal， 2010，186（3）：299-303.

［19］ BEN SHABAT M， MIKULA I， GERCHMAN I， LYSNYANSKY I. Development and evaluation of a novel single-nucleotide- polymorphism real-time PCR assay for rapid detection of fluoroquinolone-resistant Mycoplasma bovis. Journal of Clinical Microbiology， 2010， 48（8）：2909-2915.

［20］ NOTOMI T， OKAYAMA H， MASUBUCHI H， YONEKAWA T，WATANABE K， AMINO N， HASE T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research， 2000， 28：E63.

［21］ 黃火清， 郁昂. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)， 2012，22（3）： 90-94. HUANG H Q， YU A. Advances of loop-mediated isothermal amplification. Biotechnology， 2012， 22（3）：90-94. （in Chinese）

［22］ 侯軒， 付萍， 張海燕， 張躍偉， 吳文學(xué). 牛支原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)研究. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2012， 20（2）：218-224. HOU X， FU P， ZHANG H Y， ZHANG Y W， WU W X. Development of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Mycoplasma bovis. Journal of Agricultural Biotechnology， 2012，20（2）：218-224. （in Chinese）

［23］ SUBRAMANIAM S， BERGONIER D， POUMARAT F， CAPAUL S，SCHLATTER Y， NICOLET J， FREY J. Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based on the uvrC genes by PCR. Molecular and Cellular Probes， 1998， 12（3）：161-169. ［24］ LI J H， MINION F C， PETERSEN A C， JIANG F， YANG S， GUO P P，LI J X， WU W X. Loop-mediated isothermal amplification for rapid and convenient detection of Mycoplasma hyopneumoniae， World Journal of Microbiology Bioanalytic Chemistry， 2013， 29：607-616.

［25］ MARUYAMA F， KENZAKA T， YAMAGUCHI N， TANI K， NASU M. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loopmediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69 （8）：5023-5028.

［26］ FUKUTA S， OHISHI K， YOSHIDA K， MIZUKAMI Y， ISHIDA A，KANBE M. Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of tomato spotted wilt virus from chrysanthemum. Journal of Virology Methods，2004， 121（1）：49-55.

［27］ KUBOKI N， INOUE N， SAKURAI T， DI CELLO F， GRAB DJ，SUZUKI H， SUGIMOTO C， IGARASHI I. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of African Trypanosomes. Journal of clinical microbiology， 2003， 41（12）：5517-5524.

［28］ Zhang Y W， Fu P， Li J H， Jiang F， Li J X， Wu W X. Development of loop-mediated isothermal amplification method for visualization detection of the highly virulent strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） in China， African Journal of Biotechnology， 2011， 10（61）： 13278-13283.

［29］ 蔣菲， 黃書林， 徐威， 張躍偉， 劉金華， 吳文學(xué). H9亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立與熒光顯色劑的應(yīng)用. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2010， 19（1）：191-196. JIANG F， HUANG S L， XU W， ZHANG Y W， LIU J H， WU W X. Detection of H9 avian influenza virus by Loop-mediated Isothermal Amplification and Application of Fluorescent Reagent. Journal of Agricultural Biotechnology， 2010， 19（1）：191-196. （in Chinese）

［30］ 李佳禾， 李一婧， 付萍， 張躍偉， 黃書林， 郭盼盼， 蔣菲， 吳文學(xué).胸膜肺炎放線桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2009， 17（6）：948-953. LI J H， LI Y J， FU P， ZHANG Y W， HUANG S L， GUO P P， JIANG F，WU W X.Detection ofActinobacillus pleuropneumoniae by Newly Developed Loop-mediated Isothermal Amplification Method， 2009，17（6）：948-953. （in Chinese）

［31］ KLATSER P， KUIJPER S， VAN INGEN C W， KOLK A H. Stabilized，freeze-dried PCR mix for detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology， 1998， 36（6）：1798-1800.

［32］ 李美霞， 張慶利， 劉利平， 黃倢， 謝國駟. 海藻糖對(duì)冷凍干燥的LAMP反應(yīng)體系的保護(hù)效果. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展， 2012， 33（5）：95-101. LI M X， ZHANG Q L， LIU L P， HUANG J， XIE G S. The protective effects of trehalose on freeze-drying and LAMP reagents storage. Progress in Fishery Sciences， 2012， 33（5）：95-101. （in Chinese）

［33］ Production Information of Bst DNA Polymerase， Large Fragment，http：//www.neb.sg/products/m0275-bst-dna-polymerase-large-fragment.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Development of a Freeze-Dried Kit for Isothermal Amplification Assay of Mycoplasma bovis

WU Tong1， LIU Xu2， LI Jia-he2， YAN Xin-bo2， ZHANG Ning2， WU Wen-xue2
（1College of Life Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095；2College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100193）

【Objective】Mycoplasma bovis （M. bovis） is a pathogen related to a variety of syndromes of infected cattle， and itspreads widely in the world. For the survey of the epidemiology of M. bovis in China， simple and sensitive kits are needed.【Method】A recombinant plasmid with the uvrC gene of M. bovis was constructed and transfected into TOP10 competent cell， by which a strain of recombinant Escherichia coli was selected. The recombinant plasmid rP-uvrC was extracted， purified and diluted to the concentration of 104copies/μL， which was used as the positive control. Betaine solution and color developing solution （mixture of SYBR Green I and HNB） were prepared to solve the freeze-dried amplification reagent and visualize the result of the amplification reaction， respectively， according to the published reports. Three kinds of freeze-drying protective agent which did not inhibit the amplification reaction were selected from 8 agents generally used to produce vaccine， then they were combined by different ratios to form 27 combinations， and the best combination was selected according to the physical characters. The isothermal amplification reagent made with the best freeze-drying protective agents were transported to the lyophilizer to detect the eutectic point， and the best heating-up time of the first drying， the first and the second drying times were determined. The best lyophilizing curve was selected to lyophilized the isothermal amplification reagent by testing of the physical characters， vacuum and residual water content. The lyophilized isothermal amplification kit consists of one tube of lyophilized isothermal amplification agent， betaine solution， positive control and color developing solution. The sensitivity of the kit was determined with a series of rP-uvrC solutions （100-105copies），and the specificity was determined with 104CCU·mL-1solutions of M.bovis strains PG-45， HB-1， SD-2， 108CCU·mL-1solutions of M. bovirhinis and M. agalactiae， and 108CFU·mL-1Pasteurella multocida and Tuberculosis mycobacteria， respectively. The steady of the kit was also evaluated under different temperatures.【Result】Among the 8 freeze-drying protective agents， only trehalose，mannitol and bovine serum albumin did not interfere the isothermal amplification reaction， and the best freeze-drying protective agents composition is 5% trehalose +1.25% mannitol +1.25% bovine serum albumin. The eutectic point was -16℃， and the best heating-up time of the first drying was 3h， the first and the second drying times are 6h and 4h， respectively. The detection limit of the freeze-dried kit is 10 copies， 104CCU·mL-1solutions of M.bovis strains PG45， HB-1 and SD-2 showed positive results， 108CCU·mL-1solutions of M. bovirhinis and M. agalactiae， 108CFU·mL-1Pasteurella multocida and Tuberculosis mycobacteria showed negative results. The sensitivity of the kit didn't change even it was stored for 6 months under 20℃ or 10 d under 37℃. So， the shelf life of the freeze-dried kit could be about 24 months.【Conclusion】The above results suggest that the freeze-dried kit has higher sensitivity， specificity and stability， could be used as a point-of-care （POC） test product since it is convenient for storage and very easy for the veterinarians to use in the farms.

Mycoplasma bovis； loop-mediated isothermal amplification； freeze-drying； kit； RT-PCR

2016-03-15；接受日期：2016-06-04

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203056-2）

聯(lián)系方式：吳彤，E-mail： labboard@126.com。劉旭，E-mail： liuxu1987@126.com。吳彤與劉旭為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者吳文學(xué)，E-mail： wuwenxue @cau.edu.cn