趙新節(jié)，姜凱凱，，孫玉霞，張　將，，王霄倩，3

（1.齊魯工業(yè)大學生物工程學院，山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南250353； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟南250100； 3.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安271018）

氮源對葡萄酒中揮發(fā)性化合物含量的影響研究

趙新節(jié)1，姜凱凱1，2，孫玉霞2，張將1，2，王霄倩2，3

（1.齊魯工業(yè)大學生物工程學院，山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南250353； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟南250100； 3.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安271018）

選取云南省德欽縣阿東、紅坡、東水和布村4個村莊葡萄園的赤霞珠葡萄，測定葡萄汁中氨基酸和酵母可同化氮含量，并對所釀葡萄酒中揮發(fā)性化合物含量進行測定，分析葡萄汁中酵母可同化氮含量與葡萄酒中揮發(fā)性化合物含量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，葡萄酒中異丁醇與葡萄汁中纈氨酸含量相關(guān)，葡萄酒中乙酸己酯和乙酸乙酯與葡萄酒中絲氨酸含量相關(guān)，葡萄酒中總酯與葡萄汁中總氨基酸含量相關(guān)；葡萄酒中正己醇和苯甲醇、乙酸苯乙酯、己酸和辛酸與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)，而異丁醇和丁二酸二乙酯與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈負相關(guān)。

氨基酸； 酵母可同化氮； 揮發(fā)性化合物； 葡萄酒

酵母在葡萄酒發(fā)酵期間主要的營養(yǎng)物質(zhì)來源于葡萄，在大多數(shù)情況下，葡萄汁能夠提供足夠的糖、可利用氮、無機化合物和生長因子以滿足發(fā)酵需要，如果葡萄汁重要營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，可以通過添加蔗糖或濃縮葡萄汁（加糖），或添加含無機銨和維生素的補充劑（維生素B1）。為了完成酒精發(fā)酵，釀酒酵母需要酵母可同化氮的濃度為140 mg/L［1］，同時氮需求的增長隨著葡萄汁中的糖類濃度的增加而增加［2］。

葡萄汁是含有氨基酸和其他含氮化合物的復(fù)雜混合物，葡萄中含氮化合物濃度和分布受葡萄品種、砧木、營養(yǎng)條件、季節(jié)性條件和成熟程度的影響［3］。在自然環(huán)境中的酵母有使用大量含氮化合物作為唯一氮源的能力，但不是所有的含氮化合物都適合酵母生長和發(fā)酵活性的優(yōu)化。事實上，釀酒酵母細胞能夠選擇性地優(yōu)先使用良好的氮源，這種選擇性是基于代謝物的阻遏機制，即當優(yōu)良氮源存在時，劣質(zhì)氮源代謝所需基因的轉(zhuǎn)錄受到了抑制［4］。在葡萄汁中主要的含氮化合物是游離氨基酸和銨離子，這構(gòu)成了葡萄汁中2%～53%的酵母可同化氮［3］。酵母可同化氮為銨態(tài)氮和氨基酸的總和減去脯氨酸的含量，低濃度的可同化氮與低生物量［5］是導致緩慢的、不完全的發(fā)酵主要因素之一［6-7］，并且伴隨著硫化物（如H2S）的頻繁生產(chǎn)［8］。大量的研究表明，葡萄汁中的可同化氮濃度以及氮源的補充時間，有利于調(diào)節(jié)發(fā)酵酒中香氣物質(zhì)的形成［9-13］。

本實驗采用云南省德欽縣4個村莊葡萄園的赤霞珠葡萄為原料，通過對葡萄汁中氨基酸、酵母可同化氮含量，以及所釀葡萄酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定，探尋葡萄汁中氮源物質(zhì)與葡萄酒香氣物質(zhì)含量的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

原料：赤霞珠葡萄，2014年9月30日分別采自云南德欽縣阿東、紅坡、東水、布村，株行距1.0×2.0 m，單干雙臂，常規(guī)管理。

試劑：偏重亞硫酸鉀（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醛溶液（分析純），萊陽市康德化工有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司；氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純，98%），美國Aldrich公司。

儀器：日立L-8900全自動氨基酸分析儀，日立高新技術(shù)公司；SPME手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭（50/30 μm），美國Supelco公司；GC-7890B/MS-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、VF-WAXms（30 m× 0.32 mm×0.25μm）色譜柱，美國Agilent公司。

1.2葡萄酒釀造

葡萄樣品各5 kg除梗和破碎后放入容積為5 L的帶蓋廣口瓶中，添加偏重亞硫酸鉀使總SO2濃度達到50 mg/L，浸漬24 h后按照0.2 g/L添加D254酵母于葡萄醪中，室溫發(fā)酵。

發(fā)酵期間，每天通過比重計測定葡萄酒比重，直到比重＜0.996、殘?zhí)牵? g/L，皮渣分離。酒樣放置于玻璃瓶中，密封貯存于-40℃待測。

1.3分析方法

1.3.1酵母可同化氮含量測定

采用甲醛滴定法測定葡萄汁中酵母可同化氮的含量。取5 mL葡萄汁，加入45 mL去離子水，加入5 mL甲醛，用氫氧化鈉溶液滴定至pH9.0，重復(fù)3次。

可同化氮（mgN/L）=（V1×C×14×D×1000）/V2

式中：V1——氫氧化鈉體積，L；

C——氫氧化鈉濃度，mg/L；

D——稀釋倍數(shù)；

V2——樣品體積，L。

1.3.2游離氨基酸含量測定

使用日立L-8900全自動氨基酸分析儀測定葡萄汁中氨基酸含量。采用4.6 mm ID×60 mm色譜柱，日立專用離子交換樹脂，柱溫箱設(shè)定57℃，使用可見光檢測器：波長為570 nm和440 nm，進樣量20 μL，流速0.40 mL/min，梯度洗脫，洗脫時間35 min。

1.3.3揮發(fā)性化合物測定

酒樣通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定可揮發(fā)性化合物［9，14］。色譜分析在配備有5977A MSD的Agilent 7890B氣相色譜儀上進行。揮發(fā)性化合物用VFWAXms（30 m×0.32 mm）的毛細管氣相色譜柱（Agilent，Santa Clara，CA，USA）分離。具體操作如下，在15 mL頂空瓶中加入8 mL發(fā)酵結(jié)束葡萄酒，1.5 g NaCl和20 mL 的2.00 g/L內(nèi)標物4-甲基-2-戊醇，以及轉(zhuǎn)子。放置于45℃的可加熱磁力攪拌器上，預(yù)熱10 min后進行萃取，萃取50 min后進樣。解析10 min，解析結(jié)束后，柱子在40℃下保持2 min，然后以6℃/min升到230℃，保持15 min。載氣為氦氣，平均線速度為25 cm/s。不分流進樣。所有質(zhì)譜在70 eV下沖擊，掃描范圍為30～400原子質(zhì)量單位，在每秒3.9次掃描速度下獲得。采用內(nèi)標法確定揮發(fā)性化合物的含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用One-WayANOVA法，兩組間相關(guān)性采用Person’s法。

2　結(jié)果與分析

2.1不同葡萄園葡萄汁酵母可同化氮、氨基酸含量

本實驗選取了云南省德欽縣葡萄酒產(chǎn)區(qū)的4塊不同的葡萄園，分別是阿東、紅坡、東水和布村，各葡萄園葡萄汁中酵母可同化氮含量分析結(jié)果見表1。

表1　不同實驗葡萄園的葡萄汁可同化氮（mg/L）和氨基酸（%）

由表1可知，4個葡萄園的葡萄中酵母可同化氮含量存在顯著性差異（p＜0.05），含量最高的為阿東，其次是布村，最少的是紅坡；且氨基酸含量在4個葡萄園中也存在差異，葡萄中氮源含量主要與葡萄園氮肥施用量、葡萄園的管理以及葡萄園的氣候條件相關(guān)。

2.2不同葡萄園葡萄酒揮發(fā)性化合物差異性分析

通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定葡萄酒中與酵母氮源代謝相關(guān)的揮發(fā)性化合物，4個葡萄園的葡萄酒中共檢測出46種醇類、酸類、酯類揮發(fā)性化合物，其中阿東、紅坡、東水和布村分別檢測出37種、38種、35種、43種揮發(fā)性化合物，布村檢測到的揮發(fā)性化合物種類最多，且與其余3個酒樣相差較大，東水檢測到的揮發(fā)性化合物種類最少，各揮發(fā)性化合物含量見表2。

表2　不同實驗葡萄園的葡萄酒揮發(fā)性化合物含量?。é蘥/L）

由表2可知，4個葡萄園的葡萄所釀葡萄酒揮發(fā)性化合物含量相差較大，其中阿東揮發(fā)性化合物總量為6680.23 μg/L，在4個葡萄酒樣中含量最高，其次是東水、布村和紅坡，分別為5547.17 μg/L、5214.91 μg/L和4732.36μg/L。苯甲酸乙酯僅在阿東葡萄酒中檢測到；正丁醇僅在東水和布村葡萄酒中檢測到；癸醇、1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）、正戊醇、香茅醇和2-乙烯酸僅在紅坡和布村葡萄酒中檢測到；辛酸-3-甲基丁酯僅在紅坡和東水葡萄酒中檢測到；壬酸、丁內(nèi)酯、辛酸甲酯和乳酸乙酯僅在阿東和布村葡萄酒中檢測到；水楊酸乙酯僅在布村葡萄酒中未檢測到；3-甲硫基-1-丙醇和3-乙氧基-1-丙醇僅在紅坡葡萄酒中未檢測到；4-甲基-1-戊醇，正辛醇和2-甲基-1-己醇僅在阿東葡萄酒中未檢測到。

表3　不同實驗葡萄園的葡萄酒揮發(fā)性化合物含量與可同化氮相關(guān)性

2.3可同化氮與葡萄酒揮發(fā)性化合物含量的相關(guān)性

2.3.1醇類

由表2可知，共檢測出19種醇類。在葡萄酒中，高級醇指擁有超過2個碳原子的醇［15］，當濃度低于300 mg/L時，高級醇有助于增加葡萄酒的復(fù)雜度［16］。當它們的濃度超過400 mg/L時，高級醇作為葡萄酒的一個消極的品質(zhì)因數(shù)。

由表3可以看出，正己醇和苯甲醇與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)，阿東酵母可同化氮含量為479.93 mg/L，是4個葡萄園中最高的；布村次之，為425.08 mg/L；再就是東水395.37 mg/L；最低的是紅坡，為346.24 mg/L，本實驗中，正己醇和苯甲醇含量同樣也表現(xiàn)這樣的趨勢，而異丁醇與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈負相關(guān)。Teresa Garde-Cerda′n等［11］添加不同濃度氨基酸于葡萄汁中，最后測其香氣物質(zhì)含量，結(jié)果同樣表明正己醇和苯甲醇與添加到葡萄汁中氨基酸含量呈正相關(guān)，與異丁醇含量呈負相關(guān)。正己醇、苯甲醇和異丁醇的形成與葡萄汁中可同化氮的含量有直接關(guān)系，它們的形成可能主要是由埃利希途徑產(chǎn)生。本實驗中檢測到的其他醇類的含量與添加到葡萄汁中的可同化氮含量沒有顯著的相關(guān)性（表2）。

2.3.2酸類

脂肪酸使葡萄酒有著新鮮，或者是不愉快的味道，如果它們過量，也有助于掩蓋其他味覺感受［17］。從表2可看出，共檢測出10種酸類。由表3可看出，己酸和辛酸與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)。酵母合成的脂肪酸與碳水化合物的代謝有關(guān)，因為葡萄糖是它的前體乙酰輔酶A的主要來源［18］，葡萄汁中氨基酸的添加很有可能對酸的形成有間接影響。

2.3.3酯類

葡萄酒中的主要酯類在酵母內(nèi)部合成酶催化下，由醇和酸合成，乙酰CoA通過乙酰輔酶A與高級醇縮合形成乙酸酯類［19］，乙基酯通過酶催化乙醇和活躍的中長鏈脂肪酸而形成［18］。乙酸乙酯通常是葡萄酒中含量最豐富的酯。當葡萄酒中乙酸乙酯的濃度高于150 mg/L，能給葡萄酒帶入不愉快的氣味（酸味）［20］。

在本研究中，共檢測出24種酯類，乙酸乙酯的濃度與添加到葡萄汁中的酵母可同化氮的濃度無顯著相關(guān)性（表2）。由表3可以看出，乙酸苯乙酯與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)，丁二酸二乙酯與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈負相關(guān)。Teresa等［11］研究發(fā)現(xiàn)，丁二酸二乙酯和3-羥基丁酸乙酯的形成與添加到葡萄汁中的氨基酸數(shù)量成反比例關(guān)系。

2.4游離氨基酸與葡萄酒中揮發(fā)性化合物的相關(guān)性

研究表明，纈氨酸與異丁醇的合成相關(guān)［21］。本實驗測定紅坡纈氨酸含量最高（表3），且異丁醇含量（表2）也是這4個葡萄酒中含量最高的，正好印證以前的研究。Fukuda等［22］研究表明，絲氨酸參與了乙酸酯水解酶的催化活性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，東水葡萄汁中的絲氨酸含量最高（表3），而東水葡萄酒中乙酸己酯和乙酸乙酯含量（表2）最低。在酒精發(fā)酵期間，釀酒酵母能夠?qū)被嵬ㄟ^埃里希途徑來生產(chǎn)各種揮發(fā)性芳香化合物［23］。本實驗表明，布村葡萄汁中總氨基酸含量最高（表3），且葡萄酒中總酯含量也為最高（表2）。

3　結(jié)論

本實驗表明，葡萄酒中異丁醇與葡萄汁中纈氨酸相關(guān)，葡萄酒中乙酸己酯和乙酸乙酯與葡萄酒中絲氨酸相關(guān)，葡萄酒中總酯與葡萄汁中總氨基酸相關(guān)；正己醇和苯甲醇與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)，而異丁醇與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈負相關(guān)，己酸和辛酸與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)，乙酸苯乙酯與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相關(guān)，而丁二酸二乙酯與葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈負相關(guān)?？梢哉f，在濃度研究中，葡萄汁中酵母可同化氮在一定范圍內(nèi)有利于在葡萄酒中的揮發(fā)性化合物的形成。本研究對生產(chǎn)和進一步的研究酵母可同化氮提供參考價值。

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Effects of Nitrogen Sources on Volatile Compounds Content in Grape Wine

ZHAO Xinjie1，JIANG Kaikai1，2，SUN Yuxia2，ZHANG Jiang1，2and WANG Xiaoqian2，3
（1.Shandong Key Lab of Microbial Engineering，College of Biological Engineering，Qilu University of Technology，Ji’nan，Shandong 250353；2.Institute ofAgro-Food Science and Technology，ShandongAcademy ofAgricultural Sciences，Ji’nan，Shandong 250100；3.College of Food Science and Engineering，ShandongAgricultural University，Taian，Shandong 271018，China）

The content of amino acid and yeast assimilable nitrogen in grape juice（Cabernet Sauvignon grape from four different village vineyards（Adong，Hongpo，Dongshui，Bucun）in Deqin，Yunnan）was measured.In addition，the content of volatile compounds in grape wine produced by these grape juice was determined.And the relations between the content of yeast assimilable nitrogen in grape juice and the content of volatile compounds in wine were analyzed.The results suggested that，isobutyl alcohol in wine was associated with valine content in grape juice，hexyl acetate and ethyl acetate in wine were associated with toserine content in grape juice，total esters content in wine was associated with total amino acids content in grape juice；hexanol，benzyl alcohol，phenethyl acetate，hexanoic acid and octanoic acid in wine were positively correlated to the content of yeast assimilable nitrogen，and isobutanol and diethyl ester butanedioic were negatively correlated to the content of yeast assimilable nitrogen in grape juice.

animo acids；yeast assimilable nitrogen；volatile compounds；wine

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）08-0044-05

10.13746/j.njkj.2016100

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GNC113010）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項基金（SDAIT-03-021-12）；泰山學者工程專項經(jīng)費；云南省建立農(nóng)科教相結(jié)合新型農(nóng)業(yè)社會化服務(wù)體系試點項目（2014NG005）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題（2013）。

2016-03-22

趙新節(jié)（1962-），男，教授，博士；姜凱凱（1989-），男，在讀研究生。

孫玉霞（1973-），女，副研究員，碩士。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-06-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160603.1613.006.html。