劉顯灼，艾芬

（湖北省武漢市中心醫(yī)院 急診科，湖北 武漢 430014）

論著

Brahma相關(guān)基因1在脂多糖誘導(dǎo)的急性肝炎中的作用

劉顯灼，艾芬

（湖北省武漢市中心醫(yī)院 急診科，湖北 武漢 430014）

目的觀察Brahma相關(guān)基因1（BRG1）在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肝炎中的表達(dá)變化，并觀察干預(yù)BRG1表達(dá)對(duì)炎癥因子分泌的影響。方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，腹腔注射LPS（2.5mg/kg）構(gòu)建小鼠肝炎模型，通過免疫組織化學(xué)及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測BRG1的表達(dá)變化；體外實(shí)驗(yàn)，在人肝細(xì)胞HepG2及HepaRG培養(yǎng)基中加入LPS（100 ng/m l），Western blot檢測BRG1的表達(dá)變化，轉(zhuǎn)染BRG1質(zhì)?；蛱禺愋詓iRNA，通過ELISA檢測白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎因子的分泌。結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，腹腔注射LPS（2.5mg/kg）可以顯著誘導(dǎo)小鼠的肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞核濃聚，肝小葉組織結(jié)構(gòu)破壞及ALT、AST的水平明顯升高；同時(shí)LPS處理后肝細(xì)胞中的BRG1表達(dá)上升，BRG1在細(xì)胞核中濃聚。體外實(shí)驗(yàn)，LPS（100 ng/m l）處理后的HepG2及HepaRG細(xì)胞中BRG1的表達(dá)升高。同時(shí)BRG 1過表達(dá)可顯著促進(jìn)促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放，相反BRG1沉默后可顯著抑制促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。結(jié)論LPS可促進(jìn)小鼠肝臟中及體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的BRG1蛋白表達(dá)，干預(yù)BRG 1表達(dá)可影響細(xì)胞釋放IL-1、IL-6及TNF-α的能力。

Brahma相關(guān)基因1；脂多糖；急性肝炎；促炎因子

SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物是目前許多真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵因素，BRG1作為SWI/SNF的催化酶，不僅廣泛參與包括細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化在內(nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)，在胚胎發(fā)育和腫瘤抑制中也發(fā)揮著重要的作用。如AGALIOTI等人[1]的研究表明BRG1通過靶向調(diào)節(jié)特定核小體的重塑活動(dòng)，介導(dǎo)SWI/SNF復(fù)合物參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)效應(yīng)；BRG1可調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附分子的水平，促進(jìn)白細(xì)胞的黏附作用[2-3]；BRG1也可調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）的活性[4]。但BRG1自身在炎癥發(fā)展過程中的表達(dá)及其對(duì)于促炎因子的影響并不十分清楚。細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）作為革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，具有內(nèi)毒素的作用，能夠激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究中，筆者在C57BL小鼠腹腔注射LPS（2.5mg/kg）構(gòu)建體內(nèi)的肝炎模型，在人肝細(xì)胞HepG2及HepaRG培養(yǎng)基中加入LPS（100 ng/m l）建立體外模型，分別檢測BRG1的蛋白表達(dá)變化，并觀察干預(yù)BRG1表達(dá)對(duì)細(xì)胞中促炎因子分泌的影響。

1　材料與方法

1.1材料

雌性C57BL小鼠購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)受武漢市中心醫(yī)院、華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人肝癌細(xì)胞HepG2及人永生化正常肝細(xì)胞HepaRG購自中科院上海細(xì)胞庫，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于5%二氧化碳CO2，37℃培養(yǎng)箱中。

胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自武漢啟動(dòng)子生物有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，BRG1、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，促炎因子白細(xì)胞介素1（Interleukin 1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（Interleukin 6，IL-6）及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor a，TNF-a）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，BRG1質(zhì)粒購自山東維真生物有限公司，并經(jīng)測序檢測，BRG1特異性siRNA（序列為5'-GGACCUGAAUGA GGAGGAA-3'）及LPS購自美國Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型及藥物誘導(dǎo)將8～9周齡的C57BL雌性小鼠飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系動(dòng)物中心，遵循12 h/12 h晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食飼料及飲水。按照小鼠體重給以腹腔注射LPS（2.5mg/kg）作為實(shí)驗(yàn)組，給以等量生理鹽水（NS）腹腔注射作為對(duì)照組，每組8只，8 h后處死小鼠，分別取肝臟組織及血清樣本行相關(guān)檢測。該實(shí)驗(yàn)得到華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院及武漢市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2細(xì)胞藥物處理及轉(zhuǎn)染LPS以100 ng/ml的終濃度處理HepG2及HepaRG細(xì)胞，等量生理鹽水作為對(duì)照組，8 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清及細(xì)胞行相關(guān)檢測。BRG1過表達(dá)質(zhì)粒及特異性siRNA按照Lipofectamine 2000試劑說明書常規(guī)轉(zhuǎn)染48 h后行相關(guān)檢測，以空質(zhì)粒及無意亂序siRNA作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組。

1.2.3ELISA檢測細(xì)胞分泌IL-1、IL-6及TNF-α將HepG2及HepaRG細(xì)胞以1×106個(gè)/孔密度接種于6孔板，按照上述方法轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騭iRNA，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)基上清，離心去固體沉淀后按照 ELISA試劑盒檢測其中的 IL-1、IL-6及TNF-α含量，并以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及無意亂序siRNA組作為1，計(jì)算相對(duì)的蛋白含量繪圖。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4蛋白免疫印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn)收集肝臟組織并勻漿，收集LPS處理后或轉(zhuǎn)染處理后的HepG2及HepaRG細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液(每1×106個(gè)細(xì)胞加入100μl裂解液)，獲取細(xì)胞總蛋白液，加入SDS上樣緩沖液100℃水浴解除蛋白交聯(lián)。各組蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉1 h，然后依次孵育一抗4℃過夜及辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫1 h后化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測細(xì)胞中BRG1表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5免疫組織化學(xué)法收集LPS處理后的小鼠肝臟加入多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，并行HE染色及BRG1的免疫組織化學(xué)染色。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞變化及BRG1的陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)弱。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1LPS對(duì)小鼠肝炎模型中BRG 1表達(dá)的影響

將LPS處理后及對(duì)照組的小鼠肝臟行HE染色及免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果提示腹腔注射LPS（2.5 mg/kg）可以顯著誘導(dǎo)小鼠肝炎發(fā)生，表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞核濃聚，肝小葉組織結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)伴隨ALT及AST的水平明顯升高；同時(shí)觀察到LPS處理后肝細(xì)胞中的BRG1表達(dá)上升，BRG1在細(xì)胞核中濃聚。同時(shí)將肝組織裂解，Western blot實(shí)驗(yàn)同樣提示肝細(xì)胞中的BRG1的表達(dá)升高（見圖1）。

圖1　LPS對(duì)小鼠肝炎模型中BRG 1表達(dá)的影響

2.2LPS對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞中的BRG 1表達(dá)及促炎因子釋放的影響

將LPS（100 ng/m l）處理后的HepG2及HepaRG細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基上清分別行Western blot實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果提示LPS可顯著促進(jìn)細(xì)胞中BRG1的表達(dá)，并且升高細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的IL-1、IL-6及TNF-α含量。IL-1：HepG2+LPS vs HepG2，（13.541±0.140）vs（1.000±0.021），P<0.05；HepaRG+LPS vs HepaRG，（10.010±0.242）vs（1.000±0.112），P<0.05。 IL-6：HepG2+LPS vs HepG2，（9.431±0.262）vs（1.000±0.051），P<0.05；HepaRG+LPS vs HepaRG，（16.321±0.502）vs（1.000±0.050），P<0.05。TNF-α：HepG2+LPS vs HepG2，（15.231±0.153）vs（1.000±0.071），P<0.05；HepaRG+LPS vs HepaRG，（7.923±0.114）vs（1.000±0.020），P<0.05（見圖2和表1）。

圖2　LPS對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞中的BRG 1表達(dá)及促炎因子釋放的影響

表1　LPS對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞中的BRG1表達(dá)及促炎因子釋放的影響 （）

表1　LPS對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞中的BRG1表達(dá)及促炎因子釋放的影響 （）

組別HepaRG+LPS IL-1　1.000±0.021　13.541±0.140 1.000±0.112　10.010±0.242 IL-6　1.000±0.051　9.431±0.262　1.000±0.050　16.321±0.502 TNF-α　1.000±0.071　15.231±0.153 1.000±0.020　7.923±0.114 HepG2 HepG2+LPS HepaRG

2.3BRG 1過表達(dá)對(duì)促炎因子釋放的影響

將轉(zhuǎn)染BRG1過表達(dá)質(zhì)粒后的HepG2及HepaRG的細(xì)胞培養(yǎng)基上清行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果提示BRG1過表達(dá)可顯著促進(jìn)促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α 的釋放。IL-1：HepG2+BRG1 vs HepG2，（6.881±0.154）vs（1.000±0.022），P<0.05；HepaRG+BRG1 vs HepaRG，（6.313±0.211）vs（1.000±0.031），P<0.05。 IL-6：HepG2+BRG1 vs HepG2，（6.010±0.263）vs（1.000±0.020），P<0.05；HepaRG+ BRG1 vs HepaRG，（12.161±0.493）vs（1.000±0.010），P<0.05。TNF-α：HepG2+BRG1 vs HepG2，（9.134±0.122）vs（1.000±0.024），P<0.05；HepaRG+ BRG1 vs HepaRG，（7.783±0.111）vs（1.002±0.014），P<0.05（見圖3和表2）。

2.4 BRG 1沉默對(duì)促炎因子釋放的影響

將轉(zhuǎn)染BRG1特異性siRNA后的HepG2及HepaRG的細(xì)胞培養(yǎng)基上清行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果提示BRG1沉默后可顯著抑制促炎因子IL-1、IL-6及 TNF-α 的釋放。IL-1：HepG2+siBRG1 vs HepG2，（0.161±0.030）vs（1.000±0.020），P<0.05；HepaRG+siBRG1 vs HepaRG，（0.163±0.014）vs（1.000±0.102），P<0.05。IL-6：HepG2+siBRG1 vs HepG2，（0.200±0.011）vs（1.000±0.051），P<0.05；HepaRG+siBRG1 vs HepaRG，（0.084±0.051）vs（1.002±0.050），P<0.05；TNF-α：HepG2+siBRG1 vs HepG2，（0.113±0.024）vs（1.000±0.071），P<0.05；HepaRG+siBRG1 vs HepaRG，（0.153±0.033）vs（1.001±0.020），P<0.05（見圖4和表3）。

圖3　BRG1過表達(dá)對(duì)促炎因子釋放的影響

表2　BRG 1過表達(dá)對(duì)促炎因子釋放的影響 （）

表2　BRG 1過表達(dá)對(duì)促炎因子釋放的影響 （）

組別HepaRG+BRG1 IL-1　1.000±0.022　6.881±0.154 1.000±0.031　6.313±0.211 IL-6　1.000±0.020　6.010±0.263 1.000±0.010　12.161±0.493 TNF-α　1.000±0.024　9.134±0.122 1.002±0.014　7.783±0.111 HepG2 HepG2+BRG1 HepaRG

圖4　BRG1沉默對(duì)促炎因子釋放的影響

表3　BRG 1沉默對(duì)促炎因子釋放的影響 （）

表3　BRG 1沉默對(duì)促炎因子釋放的影響 （）

組別HepaRG+siBRG1 IL-1　1.000±0.020　0.160±0.030　1.000±0.102　0.163±0.014 IL-6　1.000±0.051　0.200±0.011　1.002±0.050　0.084±0.051 TNF-α　1.000±0.071　0.113±0.024　1.001±0.020　0.153±0.033 HepG2 HepG2+siBRG1 HepaRG

3　討論

目前研究表明，炎癥激活時(shí)，如在LPS刺激下，核因子κB（nuclear factor κB，NF κB）中的p65亞基可磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于炎癥因子的啟動(dòng)子區(qū)域。而且BRG1自身也可與NFκB中的p65亞基相結(jié)合，那么是否BRG1也是通過類似的募集過程，參與炎癥反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程調(diào)控[5-6]。本研究提示LPS刺激下BRG1的表達(dá)水平在體內(nèi)肝臟組織中及體外肝細(xì)胞中都有明顯的升高，尤其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在LPS激活炎癥的過程中，BRG1在細(xì)胞核中發(fā)生濃聚效應(yīng)，有可能通過募集于促炎因子的核小體附近，重塑其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞中IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。

BRG1是SW I/SNF復(fù)合體中的關(guān)鍵催化亞基，它通過對(duì)ATP水解為整個(gè)復(fù)合體供能使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致基因序列上啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)暴露、易化轉(zhuǎn)移因子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的結(jié)合，從而參與調(diào)控目的基因的表達(dá)[7]。SWI/SNF催化亞基的降解，抑制其活性染色質(zhì)重塑。現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，BRG1在心肌發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中有十分重要的作用，相關(guān)數(shù)據(jù)提示，抑制BRG1的表達(dá)將導(dǎo)致心肌發(fā)育以及中樞神經(jīng)系發(fā)育障礙[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞中BRG1的表達(dá)，能夠顯著下調(diào)促炎因子的分泌，而過表達(dá)BRG1相反可以促進(jìn)IL-1、IL-6及TNF-α的分泌，這提示BRG1在LPS誘導(dǎo)的急性炎癥過程中可能扮演著重要的角色。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎中，BRG1的蛋白表達(dá)水平顯著上升，并在細(xì)胞核中濃聚。而LPS作用于體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，也可明顯促進(jìn)細(xì)胞中BRG1的表達(dá)。同時(shí)肝臟細(xì)胞中過表達(dá)BRG1，可促進(jìn)促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。相對(duì)應(yīng)的，BRG1沉默后可顯著抑制肝細(xì)胞促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的釋放。這提示BRG1在LPS誘導(dǎo)的急性炎癥過程中可能扮演著重要的角色，干預(yù)其表達(dá)有望作為治療急性炎癥的潛在藥物靶點(diǎn)。

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（張蕾編輯）

Effect of BRG1 in acute hepatitis induced by lipopolysaccharides

Xian-zhuo Liu，F(xiàn)en Ai
（Emergency Department，Wuhan Central Hospital，Wuhan，Hubei430014，China）

Objective To observe the expression of Brahma-related gene 1（BRG1）in acute hepatitis induced by lipopolysaccharide（LPS）and the effect of intervention of BRG1 expression on secretion of inflammatory factors. Methods For in vivo experiments，a hepatitis mouse model was constructed by intraperitoneal injection of LPS（2.5 mg/kg），then the expression of BRG1 was detected though immunohistochemical staining and Western blot.For in vitro experiments，LPS（100 ng/ml）was added in human liver cell line HepG2 and HepaRG culture media，and then，the expression of BRG1 was detected through Western blot.Meanwhile，BRG1 plasmid or specific siRNA was transfected into HepG2 and HepaRG cells，enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect the IL-1，IL-6 and TNF-αsecretion.Results in vivo，intraperitoneal injection of LPS could obviously induce necrosis of hepatic cells and lobules，together with condensation of nuclei in mice.Meanwhile，the expression of BRG1 was enhanced in mouse hepatic cells after procession by LPS，and accumulated in nuclei.In vitro experiments showed the expression of BRG1 in HepG2 and HepaRG cells increased after treatment by LPS（100 ng/ml）.At the same time，the overexpression of BRG1 significantly promoted the release of pro-inflammatory cytokines IL-1，IL-6 and TNF-α；the silence of BRG1 inhibited the release of IL-1，IL-6 and TNF-α.Conclusions LPS could promote the expression of BRG1 protein both in vivo and in mouse liver cell lines，and intervention of BRG1 expression mightaffect the secretion of IL-1，IL-6 and TNF-α.

Brahma-related gene 1；lipopolysaccharide；acute hepatitis；pro-inflammatory factor

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.006

1005-8982（2016）14-0027-05

2015-12-25

艾芬，E-mail：13006191071@163.com；Tel：13006191071