黃霜枝，王曉玲，張先杰，陳燕玲，唐劍濤，靳俊峰，吳秀香

（遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 1.病理學與病理生理學教研室，2.計算機教研室，廣東 珠海 519041）

論著

葡萄籽原花青素對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈重構的改善作用研究*

黃霜枝1，王曉玲1，張先杰1，陳燕玲1，唐劍濤2，靳俊峰1，吳秀香1

（遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 1.病理學與病理生理學教研室，2.計算機教研室，廣東 珠海 519041）

目的探討葡萄籽原花青素（GSP）對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）主動脈重構的改善作用。方法8周齡雄性SHR 24只隨機分為4組，每組6只：SHR組、GSP低劑量（50mg/kg）、高劑量組（200mg/kg）以及卡托普利組（30mg/kg）。6只同齡雄性W istar-Kyoto大鼠設為對照組。每周測定尾動脈收縮壓（SBP）；治療6周后HE染色下測定胸主動脈中膜橫截面積（MCSA）、管腔面積（LA）及MCSA/LA；M asson三色法測量胸主動脈膠原容積分數(shù)（CVF）；ELISA法測定胸主動脈中Ⅰ型膠原（ColⅠ）含量；生化法檢測大鼠胸主動脈中過氧化氫酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）含量；蛋白免疫印跡法（W estern blot）檢測胸主動脈中ERK1/2蛋白表達。結(jié)果GSP能顯著降低SHR SBP（P<0.01），改善血管重構參數(shù)，減少胸主動脈MDA含量以及ERK1/2蛋白的表達，提高CAT活力。結(jié)論GSP能夠改善SHR胸主動脈重構，其作用可能是通過降壓、對抗氧化應激和抑制ERK1/2蛋白表達實現(xiàn)的。

葡萄籽原花青素；自發(fā)性高血壓大鼠；重構；氧化應激；ERK1/2中國分類號：R 544.1；R 282.71

A

高血壓病這一常見的心血管疾病發(fā)展至一定階段會導致血管重構的發(fā)生，主要表現(xiàn)為血管平滑肌增殖肥厚及細胞外基質(zhì)沉積，是造成動脈粥樣硬化、心腦血管疾病及腎損害等并發(fā)癥的病理基礎[1]。因此，預防和改善血管重構在治療高血壓病中意義重大。本研究室前期實驗觀察到葡萄籽原花青素（grape seed procyanidin，GSP）具有降低腎性高血壓大鼠血壓，改善血管內(nèi)皮細胞功能及血管重塑的作用[2-4]，該研究采用自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）為研究對象，進一步探討GSP對SHR胸主動脈重構的作用及機制，為使GSP成為防治高血壓病的理想藥物提供新的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物SPF級雄性8周齡SHR大鼠24只，同周齡雄性（Wistar-kyoto，WKY）大鼠6只，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2藥物與試劑GSP由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司惠贈，純度≥95%，卡托普利（captopril）為中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品，Ⅰ型膠原（Collagen typeⅠ，ColⅠ）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及Masson染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，兔抗鼠細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗購自Abcam公司，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3主要儀器蛋白電泳儀（Bio-Rad公司），大鼠尾動脈壓測定裝置、多道生理信號采集處理系統(tǒng)RM6240型（成都儀器廠）。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與給藥24只SHR隨機分為4組：SHR組、低劑量GSP組、高劑量GSP組及卡托普利組，每組6只；6只WKY大鼠為對照組。用藥組大鼠每日灌胃給藥1次，分別為：GSP 50mg/kg和200 mg/kg、卡托普利30mg/kg；對照組及SHR組給予等量蒸餾水灌胃。每次灌胃2m l，連續(xù)灌胃6周。

1.2.2大鼠尾動脈收縮壓（systolic pressure，SBP）的測定采用tail-cuff測壓法，用大鼠無創(chuàng)尾動脈壓測定裝置和多通道生理信號采集處理系統(tǒng)進行檢測，每周測壓1次。

1.2.3胸主動脈重構形態(tài)學指標測定取大鼠主動脈弓下1 cm處胸主動脈0.5 cm，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度為4μm），行HE染色，光學顯微鏡下放大400倍觀察，用Image pro-plus 6.0圖像分析軟件分別測定并計算胸主動脈中膜橫截面積（media cross-sectional area，MCSA）、管腔面積（lumen area，LA）和MCSA/LA。

1.2.4膠原定性和半定量分析石蠟切片進行Masson染色，用Image pro-plus 6.0圖像分析軟件計算出膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）（%）=主動脈膠原面積/所測視野面積×100%。

1.2.5ColⅠ含量測定取大鼠胸主動脈制備10%勻漿液，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.6MDA和CAT的測定將大鼠胸主動脈組織制成10%的組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心5 min后取上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7總蛋白的提取和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測ERK的蛋白表達取大鼠胸主動脈制成10%組織勻漿液，加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10min使蛋白變性，12 000 r/min 4℃離心5 min取上清液，BCA法測定樣品的蛋白濃度。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)牛血清白蛋白BSA封閉、洗膜后加抗ERK抗體（1︰1 000）4℃孵育過夜，洗膜后加二抗（1︰15 000）37℃搖床孵育60min，洗膜，加ECL發(fā)光顯色劑，暗盒壓片、曝光、顯影、定影于膠片。膠片經(jīng)拍照后，用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析，以實驗各組吸光蛋白條帶平均值與同一樣品中內(nèi)參條帶的平均值比值作為蛋白的相對含量。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間正態(tài)分布的計數(shù)資料比較用單因素方差分析（ANOVA），用LSD法進行組間均數(shù)的兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1GSP對SHR SBP的影響

用藥前，SHR組和3個用藥組大鼠尾動脈SBP均較對照組明顯升高；用藥1周時，與SHR組比較，3個治療組大鼠的此項指標均有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（除外卡托普利組）。用藥2周時，與SHR組比較，高劑量GSP組和卡托普利組的此項指標均明顯降低，用藥3～6周，與對照組比較，SHR組大鼠尾動脈SBP明顯升高；與SHR組比較，3個用藥組大鼠SBP均明顯下降。見表1。

2.2GSP對SHR胸主動脈重構形態(tài)學參數(shù)的影響

與對照組比較，SHR胸主動脈管壁增厚，管腔狹窄，MCSA和MCSA/LA明顯增大（P=0.000），LA明顯減?。≒=0.000）；與SHR組比較，各用藥組MCSA增大（P=0.01、0.004和0.000）和LA減?。≒=0.047、0.000和0.000）的表現(xiàn)均有緩解，MCSA/LA增高的幅度下降（P=0.000）。見圖1和表2。

2.3GSP對SHR胸主動脈膠原含量的影響

對照組大鼠胸主動脈平滑肌細胞間藍色膠原纖維少，排列整齊，分布均勻。SHR組大鼠胸主動脈平滑肌束間見大量膠原纖維沉積，排列紊亂，CVF較WKY組明顯升高；3個用藥組大鼠上述情況均有所減輕（低劑量GSP組的CVF差異無統(tǒng)計學意義，P=0.061），以高劑量GSP組和卡托普利組作用顯著（與低劑量組比較，P=0.000）。見圖2和表3。

2.4GSP對SHR胸主動脈中ColⅠ含量的影響

灌胃6周后，SHR胸主動脈中ColⅠ的含量顯著高于對照組；與SHR組比較，3個用藥組大鼠的此項指標均有所降低，3組治療效果差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.5 GSP對SHR胸主動脈中MDA和CAT的影響

SHR胸主動脈中CAT的活性較對照組明顯降低，而MDA含量顯著升高；與SHR組比較，3個用藥組大鼠胸主動脈中CAT的活性均升高，MDA含量降低，高劑量GSP組和卡托普利組的效果尤為顯著。見表4。

2.6GSP對SHR胸主動脈中ERK1/2蛋白表達的影響

SHR組胸主動脈中的ERK1/2蛋白表達較對照組明顯增多，與SHR組比較，3個用藥組的此項指標均明顯降低，以高劑量GSP組和卡托普利組的ERK1/2蛋白表達降低明顯。見圖3和表5。

表1　GSP對SHR SBP的影響 （n=6，）

表1　GSP對SHR SBP的影響 （n=6，）

注：1）與對照組比較，P=0.000；與SHR組比較，2）P=0.338；3）P=0.069；4）P=0.004；5）P=0.001；6）P=0.000；7）P=0.079；8）P=0.034

組別6周對照組　98.80±13.45　103.96±10.80　105.69±11.01　103.13±8.74　103.43±14.79　109.80±13.68　110.28±13.66 SHR組　161.26±8.901）　166.91±6.591）　173.69±4.721）　178.76±5.851）　183.62±6.781）　184.43±6.951）　187.44±9.281）低劑量GSP組　50　162.48±5.601）　162.34±5.722）　164.62±5.863）　163.03±3.874）　161.38±8.035）　158.38±11.116）154.08±11.166）高劑量GSP組　200　161.91±7.081）　157.89±4.817）　152.13±6.556）　147.43±4.806）　144.80±6.566）　135.61±5.836）　125.14±5.586）卡托普利組　30　158.75±9.71）　156.41±10.218）152.91±10.746）145.17±14.396）132.16±13.446）　125.62±5.496）　116.98±7.346）劑量/（mg/kg）治療前SBP/mmHg治療后SBP/mmHg 1周2周3周4周5周

圖1　各組大鼠胸主動脈結(jié)構變化 （×40）

圖2　GSP對SHR胸主動脈中膠原含量的影響 （×400）

表2　GSP對SHR胸主動脈重構形態(tài)學參數(shù)的影響（n=6，）

表2　GSP對SHR胸主動脈重構形態(tài)學參數(shù)的影響（n=6，）

組別MCSA/LA對照組　3.21±0.40　10.65±0.05　0.30±0.02 SHR組　3.89±0.17　7.47±0.14　0.52±0.01低劑量GSP組　50　3.65±0.51　8.15±0.04　0.45±0.01高劑量GSP組　200　3.61±1.12　9.16±0.57　0.39±0.02卡托普利組　30　3.32±2.65　9.02±1.20　0.34±0.02劑量/（mg/kg）MCSA（×105μm2）LA（×105μm2）

表3　GSP對SHR胸主動脈CVF和ColⅠ的影響（n=6，）

表3　GSP對SHR胸主動脈CVF和ColⅠ的影響（n=6，）

注：1）與對照組比較，P=0.000；與SHR組比較，2）P=0.061；3）P=0.039；4）P=0.000；5）P=0.002；6）P=0.213；與低劑量GSP組比較，7）P=0.000；8）P=0.001；9）P=0.159

組別Col I/（ng/mgprot）對照組　49.27±1.35　1.17±0.34 SHR組　66.59±1.131）　2.80±0.591）低劑量GSP組　50　65.06±0.422）　2.13±0.393）高劑量GSP組　200　53.03±0.794）7）　1.74±0.365）6）卡托普利組　30　51.60±0.204）7）　1.69±0.808）9）劑量/（mg/kg）CVF/%

圖3　各組大鼠胸主動脈中ERK1/2蛋白表達

表4　GSP對SHR胸主動脈中MDA和CAT的影響（n=6，）

表4　GSP對SHR胸主動脈中MDA和CAT的影響（n=6，）

注：1）與對照組比較，P=0.000；與SHR組比較，2）P=0.024；3）P=0.011；4）P=0.000；與低劑量GSP組比較，5）P=0.000；6）P=0.003

組別CAT/（u/mg）對照組　9.06±0.36　18.89±0.40 SHR組　15.22±0.811）　8.16±1.061）低劑量GSP組　50　13.73±0.742）　9.49±0.193）高劑量GSP組　200　10.09±0.884）5）　16.46±0.514）5）卡托普利組　30　11.17±1.884）6）　15.74±1.404）5）劑量/（mg/kg）MDA/（nmol/mgprot）

表5　GSP對SHR胸主動脈中ERK1/2蛋白表達的影響（n=6，）

表5　GSP對SHR胸主動脈中ERK1/2蛋白表達的影響（n=6，）

注：1）與對照組比較，P=0.000；與SHR組比較，2）P=0.000；與低劑量GSP組比較，3）P=0.000；4）P=0.001

組別ERK1/2吸光度值/β-actin吸光度值對照組　0.493±0.006 SHR組　0.977±0.0151）低劑量GSP組　50　0.777±0.0152）高劑量GSP組　200　0.627±0.0162）3）卡托普利組　30　0.727±0.0122）4）劑量/（mg/kg）

3　討論

血管重構是一個動態(tài)過程，包括平滑肌細胞、成纖維母細胞和內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及重組、膠原基質(zhì)的沉積等。很多學者研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，高血壓時血流和壓力模式的改變所造成的機械負荷可使主動脈發(fā)生肥厚性重構，病理特征為管壁增厚，管腔狹窄及膠原過度合成等。本實驗結(jié)果顯示，SHR胸主動脈管壁增厚，管腔狹窄，中膜橫截面積增加，管腔面積變小，平滑肌肌束間膠原纖維增多，特別是ColⅠ含量增加，表明SHR的胸主動脈發(fā)生了重構。經(jīng)GSP治療后，上述血管重構指標減輕，說明GSP具有改善SHR胸主動脈重構的作用。

高血壓血管重構的發(fā)生是由于長期血壓升高，血管壁對管腔內(nèi)壓力、流量變化及血管壁損傷而導致的一系列適應性結(jié)構和功能改變[8]，在早期能對抗壓力負荷，但長期的這種改變會造成心、腦及腎等靶器官的損傷。因此，對抗高血壓血管重構最主要的措施就是降低血壓[9]。本研究結(jié)果顯示，GSP能顯著降低SHR的SBP，提示GSP改善高血壓主動脈重構的機制之一是其具有降壓作用。

氧化應激與高血壓病的發(fā)生發(fā)展密切相關。氧化應激時，一方面表現(xiàn)為體內(nèi)有大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積，通過激活多種信號轉(zhuǎn)導通路損傷血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，促進血管平滑肌細胞增殖和肥厚，導致膠原沉積，進而使血管壁增厚管腔狹窄從而引起高血壓血管重構的發(fā)生[9]。ROS主要由兩種含氧的自由基組成，即超氧陰離子和羥自由基。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，通過測定其含量，可間接獲知體內(nèi)自由基產(chǎn)生多少。另一方面表現(xiàn)為機體內(nèi)清除自由基的抗氧化系統(tǒng)功能減弱。CAT是體內(nèi)主要清除過氧化氫的酶，其含量減少可導致過氧化氫積聚和羥自由基形成，從而使細胞發(fā)生不可逆的損傷，引發(fā)高血壓的發(fā)生[10]。有研究表明[11]，血管外膜產(chǎn)生的CAT可以不依賴血壓的改變，而部分通過抑制外膜派生的p38MAPK的磷酸化減輕AngⅡ誘導的血管重構。本實驗發(fā)現(xiàn)，SHR胸主動脈中MDA含量增加且CAT活力降低，表明SHR體內(nèi)有氧化應激的存在。GSP能降低SHR胸主動脈中MDA含量，提高CAT活力，提示其可通過對抗氧化應激，從而減輕高血壓主動脈重構。

研究表明，細胞內(nèi)的ROS可作為第2信使激活ERK信號通路進而促進炎癥因子表達，加重氧化應激[12]，促進高血壓血管重構的發(fā)生。有學者[13]在2K1C高血壓模型上發(fā)現(xiàn)，大鼠動脈的重構伴有p-ERK1/2的表達增高，說明ERK1/2在血管重構中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，GSP可以降低SHR胸主動脈中ERK1/2的表達，提示GSP改善SHR主動脈重構的作用與抑制ERK1/2蛋白表達有關。

總之，本實驗結(jié)果表明，GSP在降壓的同時，亦可以通過降低血管組織中MDA含量和ERK1/2的蛋白表達，增強CAT的活力，以減輕高血壓的主動脈重構。鑒于GSP具有多種藥理活性，其抗高血壓主動脈重構的其他機制有待進一步探討。

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（張蕾編輯）

Effect of grape seed procyanidins on im proving aortic rem odeling in spontaneous hypertension rats*

Shuang-zhiHuang1，Xiao-lingWang1，Xian-jie Zhang1，Yan-ling Chen1，Jian-tao Tang2，Jun-feng Jin1，Xiu-xiang Wu1
（1.Department of Pathology and Pathophysiology；2.Department of Computer Science，Zhuhai Campus of Zunyi Medical College，Zhuhai，Guangdong 519041，China）

Objective To investigate the effect of grape seed procyanidins（GSP）on improving aortic remodeling in spontaneous hypertension rats（SHR）.Methods Twenty-four male SHRs（8-week old）were randomized into 4 groups with 6 in each group：SHR group，low-dose GSP and high-dose GSP groups（50 or 200mg/kg）and Captopril group（30mg/kg）.Meanwhile，6 Wistar Kyoto rats（8-week old）were served as control group.Tail systolic pressure was measured every week.After 6-week treatment，media cross-sectional area（MCSA），lumen area（LA）and MCSA/LA of thoracic aorta were calculated after HE staining.Collagen volume fraction（CVF）was examined by Masson staining.ELISA and biochemical techniques were performed to determine the type I collagen（Col I），malondiadehyde（MDA）and catalase（CAT）levels respectively.Western blot was used to detect the expression of ERK1/2 in thoracic aorta.Results GSP could significantly decrease tail systolic pressure（P＜0.01），improve vascular remodeling parameters，reduce MDA content and the expression of ERK1/2 in thoracic aorta（P＜0.05），but increase CAT activity（P＜0.05）after 6-week treatment.Conclusions GSP significantly improves thoracic aorta remodeling of SHR by lowering systolic pressure，inhibiting oxidative stress aswell as suppressing the expression of ERK1/2.

grape seed procyanidin；spontaneous hypertension rat；remodeling；oxidative stress；ERK1/2

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.003

1005-8982（2016）14-0012-05

2016-02-02

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金（No：黔省專合字【2012】91號）；貴州省科技計劃課題（No：黔科合SY字【2012】3114）

吳秀香，E-mail：wxx64@sina.com；Tel：0756-7623357