賈永林，張保華，付志新，賈延劼

（1.河南省開封市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

論著

唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的表達(dá)變化及其意義

賈永林1，張保華1，付志新1，賈延劼2

（1.河南省開封市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

目的觀察唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子（DSCAM）在淀粉樣前蛋白（APP）轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的表達(dá)變化規(guī)律，探討其意義。方法選擇月齡分別為1、3、6和12個(gè)月的APP轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對腦切片進(jìn)行染色，觀察DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的表達(dá)，應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測該蛋白在海馬中表達(dá)量的變化規(guī)律，野生型小鼠做對照。結(jié)果DSCAM主要在APP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層、海馬的錐體細(xì)胞中表達(dá)。在兩組小鼠中，DSCAM在海馬中的表達(dá)水平隨年齡增長而下降（P<0.05）。DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的表達(dá)量明顯高于同齡野生型小鼠（P<0.05）。結(jié)論DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的過度表達(dá)可能在APP小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力下降中扮演重要角色。

唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子（DSCAM）；APP轉(zhuǎn)基因小鼠；海馬；癡呆

唐氏綜合征（down syndrome，DS）的顯型是由21號染色體上的特殊基因控制區(qū)所決定的，即唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)（down syndrome critical region，DSCR）。在唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)上的基因數(shù)量的增加從而引起其產(chǎn)物的過度表達(dá)被認(rèn)為是引起DS臨床表現(xiàn)的原因[1-2]。在DS中的神經(jīng)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)包括了先天或后天發(fā)育的畸形以及和提前出現(xiàn)的癡呆相關(guān)的變化。前者包括了大腦皮質(zhì)中顆粒細(xì)胞的減少，這很可能與aspinous星形細(xì)胞類型相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，唐氏綜合征的患者從嬰兒到成人發(fā)育的過程中，腦內(nèi)神經(jīng)元突觸棘減少和神經(jīng)元胞體上的異常的棘突樣結(jié)構(gòu)[4-5]。在唐氏綜合征的患者的前額和海馬皮層中也發(fā)現(xiàn)了與年齡相關(guān)癡呆的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)，這與阿爾茨海默病中的病理改變酷似。唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子基因定位于21號染色體的q22.2～q22.3的DSCR上。該分子的序列和免疫球蛋白超家族的分子序列具有同源性[5]，提示它作為一個(gè)黏附分子的功能。研究發(fā)現(xiàn)，唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM）在生長發(fā)育期的多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，并證實(shí)其參與了神經(jīng)元的遷移、分化、增殖、生長發(fā)育、連接、維護(hù)、軸突導(dǎo)向、靶向作用、突觸間的識別、自我回避及突觸的可塑性，并最終形成正確的神經(jīng)元連接和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[5-8]。其廣泛表達(dá)提示，DSCAM的過度表達(dá)破壞了腦的生長發(fā)育和突觸的可塑性，因此可能參與了DS患者的早老性癡呆、精神發(fā)育遲滯以及周圍神經(jīng)缺陷。

在先前研究中筆者發(fā)現(xiàn)，DSCAM也在淀粉樣前蛋白（amyloid precursor protein，APP）轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層中呈現(xiàn)過度表達(dá)[3]。與DSCAM過度表達(dá)相關(guān)的APP的過度表達(dá)提示兩者之間可能存在相互調(diào)控作用，或者APP過度表達(dá)所致的神經(jīng)病理改變導(dǎo)致了反應(yīng)性的DSCAM過度表達(dá)，如阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）樣斑的沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)。APP轉(zhuǎn)基因小鼠也表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的海馬學(xué)習(xí)和記憶缺陷，甚至先于淀粉樣前體蛋白(Aβ蛋白)的大量沉積。因此，筆者進(jìn)一步研究了APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的與年齡相關(guān)DSCAM的表達(dá)變化。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

APP轉(zhuǎn)基因小鼠（采用隔代回交法將轉(zhuǎn)基因鼠攜帶的APP基因?qū)脒z傳背景清晰的近交系小鼠C57BL/6J中，建立C57BL/6J-APP同源導(dǎo)入近交系小鼠）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。月齡分別為1、3、6和12個(gè)月。同月齡野生型同種系小鼠做為對照組。

1.2主要試劑

DSCAM的一抗（16sc-79437）購自美國Santa Cruz公司，二抗（SP-9001）免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Cy3標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L A0516）購自上海市碧云天生物技術(shù)研究所，水合氯醛、多聚甲醛及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3主要方法

1.3.1樣本采集用10%水合氯醛將實(shí)驗(yàn)用小鼠以0.3～0.4ml/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉后，其四肢固定于解剖盤中，在劍突以下打開腹腔，穿過橫膈，游離出心臟組織。從左心室插入灌流針并固定，剪開右心耳，50m l注射器從心臟灌注溫生理鹽水，至灌出液變清，再用4%的多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注至小鼠死亡，斷頭取出全腦，4%的多聚甲醛溶液將所有腦組織進(jìn)行固定2周。

1.3.2免疫組織化學(xué)法將固定過的小鼠全腦用石蠟包埋，切成4μm厚的切片，切片脫蠟至水，90℃微波處理9min，以恢復(fù)DSCAM對抗血清DSCAM-2的抗原性。3%過氧化氫H2O2去離子水孵育10min，用以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，用封閉用正常山羊血清阻斷非特異性結(jié)合，室溫孵育30min，傾去，勿洗，用抗DSCAM抗體（稀釋至1∶50）將切片在4℃孵育過夜，隨后用生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體生物素化30min后，在室溫下用辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育30min。每兩個(gè)步驟之間，切片用磷酸鹽緩沖液（pH：7.2，氯化鈉NaCl：8.0 g，磷酸二氫鉀KH2PO4：0.20 g，氯化鉀KCl：0.20 g，水合磷酸氫二鈉Na2HPO4·H2O：1.56 g）充分清洗3次，每次3min。在50mmol/L的氨基丁三醇氯化氫溶液（pH：7.4）中，用0.02%的3，3'-二氨基聯(lián)苯胺和0.006%過氧化氫作用2min，再用蘇木素將切片進(jìn)行對比染色，用適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?/p>

1.3.3蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測樣本來自于月齡分別為新生、1、3、6和12個(gè)月的APP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和陰性對照小鼠的海馬。樣本取出后立即置入-80℃冰箱中冷凍保存。用標(biāo)準(zhǔn)方法完成對蛋白質(zhì)印跡的分析。蛋白質(zhì)的提?。航鈨鰳?biāo)本并在氨基丁三醇/鹽緩沖液（50 mmol/L氨基丁三醇，150 mmol/L氯化鈉，5mmol/L依地酸鈣鈉酸四鈉，2mmol/L苯甲磺?；?，1μg/ml胃酶抑素A，1μg/ml N-α-p-甲苯磺酰基-L賴氨酸氯甲基酮，pH：7.6和1%曲拉通X-100）中均勻加工處理。離心后收集上清液，用Bradford法對蛋白進(jìn)行含量測定。樣品（30或60μg/泳道）在6%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，而后電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用考馬斯亮藍(lán)對膜的未用部分染色，證實(shí)同樣數(shù)量的蛋白已經(jīng)被裝載并轉(zhuǎn)運(yùn)。用8%的脫脂乳封閉后（室溫1 h），隨之用含有1∶200的抗血清的膜孵育（4℃過夜），再用含辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000）的膜在室溫下孵育1 h。用電化發(fā)光系統(tǒng)，蛋白質(zhì)條帶在載膜上完全顯現(xiàn)出來，用放射自顯影膠片（電化發(fā)光計(jì)算機(jī)膠片；載膜）檢測到化學(xué)發(fā)光。分析底片上條帶的光密度值，以同一膜上靶蛋白光密度/β-肌動(dòng)蛋白光密度，其比值作為目的蛋白的相對光密度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）（見表1），組間兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD法），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　單因素方差分析對多組間比較

2　結(jié)果

2.1DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的表達(dá)部位

免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，DSCAM主要在野生對照小鼠（見圖1A、1C、1E）和APP轉(zhuǎn)基因小鼠（見圖1B、1D、1F）大腦皮層、小腦浦肯野細(xì)胞、海馬錐體細(xì)胞、海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞層、丘腦以及腦干神經(jīng)元中表達(dá)，主要分布在胞膜的周邊，在浦肯野細(xì)胞的軸突內(nèi)也發(fā)現(xiàn)DSCAM的表達(dá)。

2.2DSCAM在不同月齡和不同基因型小鼠海馬中的表達(dá)

Western blot證實(shí)，在APP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠中，隨著小鼠月齡的增加，DSCAM在海馬中的表達(dá)量逐漸減少（P<0.05），到達(dá)3個(gè)月時(shí)，DSCAM的表達(dá)量達(dá)到高峰，1個(gè)月齡小鼠較3個(gè)月齡小鼠DSCAM的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的表達(dá)量明顯高于同月齡的野生型對照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)存在過度表達(dá)。見表2、圖2。

圖1　DSCAM在小鼠腦內(nèi)的表達(dá)部位

表2　DSCAM在每組小鼠海馬中表達(dá)的相對光密度值Western blo t（n=10，%，）

表2　DSCAM在每組小鼠海馬中表達(dá)的相對光密度值Western blo t（n=10，%，）

注：野生型組1個(gè)月與3個(gè)月比較，P=0.540；野生型3個(gè)月與6個(gè)月比較，P=0.000；野生型6個(gè)月與12個(gè)月比較，P=0.000；轉(zhuǎn)基因組1個(gè)月與3個(gè)月比較，P=0.736；轉(zhuǎn)基因組3個(gè)月與6個(gè)月比較，P=0.000；轉(zhuǎn)基因組6個(gè)月與12個(gè)月比較，P=0.000

組別12個(gè)月野生型　51.1±1.783　50.7±1.590　42.7±1.631　35.2±1.488轉(zhuǎn)基因　80.1±1.273　79.9±1.336　45.6±1.325　40.2±1.085 P值　0.000　0.000　0.000　0.000 1個(gè)月3個(gè)月6個(gè)月

圖2　DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠和同月齡野生型小鼠海馬中的表達(dá) （n=10）

3　討論

通常認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因模型的表型是由導(dǎo)入或刪除的基因所決定的。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中存在顯著的過度表達(dá)，提示DSCAM的表達(dá)異?？赡軈⑴cAPP小鼠的神經(jīng)病理學(xué)上的改變和行為表型。實(shí)際上，這些小鼠甚至在老年斑形成之前就已經(jīng)被證實(shí)出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶缺陷。DSCAM在可塑性強(qiáng)的海馬神經(jīng)元中的表達(dá)增加是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，包含胞內(nèi)域的截短的DSCAM在突觸后的過度表達(dá)阻斷AMPA受體的聚集，而AMPA受體的聚集則是突觸可塑性持久表達(dá)所必須的，突觸可塑性持久表達(dá)則是海兔學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)[9]。因此，DSCAM的過度表達(dá)可能導(dǎo)致APP小鼠的某些表型，但仍需要更多的研究來證明這種假設(shè)。

老年斑和β淀粉樣蛋白沉積是AD患者和中年DS受試者神經(jīng)病理學(xué)核心特征。在DS中額外的APP基因?qū)е铝薃β淀粉樣蛋白早期沉積。DSCAM在衰老斑的核心和神經(jīng)突觸中的免疫反應(yīng)提示DSCAM在空斑形成中的作用。而且，DSCAM的過度表達(dá)可能通過抑制突觸生成和軸突生長的機(jī)制導(dǎo)致DS發(fā)病[6]。實(shí)際上DS患者并沒有AD患者類似的神經(jīng)病理學(xué)特征，提示DS患者的認(rèn)知功能缺陷可能是DSCAM的過度表達(dá)所致。

研究發(fā)現(xiàn)，DSCAM廣泛表達(dá)在APP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層、小腦浦肯野細(xì)胞、海馬、丘腦及腦干神經(jīng)元中[3]，這些區(qū)域涉及腦的許多種高級功能，如軀體感覺信息的輸入和加工處理、隨意運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)的學(xué)習(xí)、外顯學(xué)習(xí)和記憶。DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的表達(dá)明顯高于同月齡野生對照組，特別是在小鼠青年期。外顯記憶依賴連接齒狀顆粒細(xì)胞和海馬錐體細(xì)胞的完整的纖維以及連接海馬和其他腦區(qū)的通路，例如海馬與額葉皮層間通路。有關(guān)果蠅的研究證實(shí)DSCAM的過度表達(dá)和表達(dá)不足均會(huì)導(dǎo)致有缺陷軸突導(dǎo)向以及異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成[10]。10%～13%的DSCAM胚胎雜合子就導(dǎo)致了Bolwig神經(jīng)的軸突導(dǎo)向缺陷[25]進(jìn)一步提示神經(jīng)元可能對DSCAM的劑量特別敏感。此外，對海兔和果蠅的研究表明，在一些條件下免疫球蛋白超家族神經(jīng)蛋白量的增加會(huì)抑制突觸生長或遷移[10]。因此，過度表達(dá)的DSCAM可能引起可在DS患者中看到的異常的架構(gòu)和皮層缺陷[11]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，DSCAM在APP轉(zhuǎn)基因小鼠小腦中的過度表達(dá)可能涉及小鼠的學(xué)習(xí)運(yùn)動(dòng)能力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的缺陷，并在其中扮演重要角色[12]。在此筆者提出DSCAM在海馬中的過度表達(dá)可能參與APP轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶缺陷，其機(jī)制可能是通過改變神經(jīng)細(xì)胞的黏附性，抑制突觸和/或神經(jīng)突的生長，擾亂軸突導(dǎo)向和正常的神經(jīng)連接結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的。此外DSCAM可能促進(jìn)衰老斑的形成或者增強(qiáng)這些包涵體的神經(jīng)變性潛力。仍有必要進(jìn)一步研究DSCAM是否在DS和AD患者的海馬中存在過度表達(dá)，APP與DSCAM在表達(dá)上和功能上如何相互作用，以及DSCAM是否和怎樣獨(dú)自改變作為學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)的突觸塑形過程。

[1]ANTONARAKIS SE.10 years of genomics,chromosome 21,and down syndrome[J].Genomics,1998,51(1):1-16.

[2]JANNOT A S,PELET A,HENRION-CAUDE A,et al.Chromosome 21 scan in Down syndrome reveals DSCAM as a predisposing locus in Hirschsprung disease[J].PLoS One,2013,8(5): e62519.

[3]JIA Y L,JING L J,LI JY,et al.Expression and significance of DSCAM in the cerebral cortex of APP transgenic mice[J].Neu-rosci Lett,2011,491(2):153-157.

[4]CVETKOVSKA V,HIBBERT A D,EMRAN F,et al.Overexpression of Down syndrome cell adhesion molecule impairs precise synaptic targeting[J].Nat Neurosci.2013,16(6):677-682.

[5]MORALES D H.Down syndrome cell adhesion molecule is important for early development in Xenopus tropicalis[J].Genesis, 2014,52(10):849-857.

[6]TADROS W,XU S,AKIN O,et al.Dscam Proteins Direct Dendritic Targeting through Adhesion[J].Neuron,2016,89(3):480-493.

[7]WOJTOWICZ W M,WU W,ANDRE I,et al.A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains[J].Cell,2007,130(6):1134-1145.

[8]MILLARD SS,ZIPURSKY S L.Dscam-mediated repulsion controls tiling and self-avoidance[J].Curr Opin Neurobiol,2008,18(1): 84-89.

[9]LI H L,HUANG B S,VISHWASRAO H,et al.Dscam mediates remodeling of glutamate receptors in Aplysia during de novo and learning-related synapse formation[J].Neuron,2009,61(4):527-540.

[10]SCHMUCKER D,CLEMENS J C,SHU H,et al.Drosophila Dscam is an axon guidance receptor exhibiting extraordinary molecular diversity[J].Cell,2000,101(6):671-684.

[11]AGARWALA K L,NAKAMURA S,TSUTSUMI Y,et al.Down syndrome cell adhesion molecule DSCAM mediates homophilic intercellular adhesion[J].Brain Res Mol Brain Res,2000,79 (1/2):118-126.

[12]賈永林,景黎君,魯晶晶,等.唐氏綜合征黏附分子（DSCAM）在APP轉(zhuǎn)基因小鼠小腦內(nèi)的表達(dá)變化及其意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2011,21(34):4231-4235.

（張西倩編輯）

Expression of Down syndrome cell adhesion molecule in hippocampus of APP transgenicm ice and its significance

Yong-lin Jia1，Bao-hua Zhang1，Zhi-xin Fu1，Yan-jie Jia2
（1.Department of Neurology，the Central Hospital of Kaifeng，Kaifeng，Henan 475000，China；2.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450052，China）

Objective To investigate the changing regularity of the Down syndrome cell adhesion molecule（DSCAM）expression in the brain of amyloid precursor protein（APP）transgenic mice and explore the significance of DSCAM expression.Methods With immunohistochemistry and Western blot，the expression of DSCAM in the brains of APP transgenic mice（aged 1m，3m，6m and 12m），especially the expression pattern and location in hippocampus were detected.The control group included age-matched wide type mice.Results DSCAM was widely expressed in the cerebral cortex and hippocampal pyramidal cell layer in the APP transgenic mice.The expression of DSCAM decreased with age in the hippocampus of APP transgenic and wild-typemice（P＜0.05）.The hippocampus expression level of DSCAM in the APP transgenic mice was higher than that in the wild-typem ice（P＜0.05）.There was no significant difference in DSCAM expression between 1-month old and 3-month old mice（P＞0.05）.Conclusions We propose that over expression of DSCAM in the hippocampus might play an important role in the learning and memory defects of APP transgenic mice.

Down syndrome cell adhesion molecule；APP transgenic mouse；hippocampus；dementia

R 329；R 725.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.005

1005-8982（2016）14-0022-05

2015-12-31

賈延劼，E-mail：jiayanjie1971@yahoo.com.cn；Tel：0371-66295112