胡鴻惠，于文濤，黃健強，南文金，吳靜波（韶關(guān)學院資產(chǎn)與實驗室管理處動物疫病實驗室，廣東韶關(guān)512005）

現(xiàn)代商品仔豬腎細胞系SDPK-D的培育

胡鴻惠，于文濤，黃健強，南文金，吳靜波
（韶關(guān)學院資產(chǎn)與實驗室管理處動物疫病實驗室，廣東韶關(guān)512005）

將胰酶消化法和差速貼壁等方法相結(jié)合，分離純化仔豬腎上皮細胞，在體外進行傳代培養(yǎng)，成功得到一株可以連續(xù)傳代的細胞株SDPK-D.SDPK-D是首次針對現(xiàn)代商品豬培育的新的傳代細胞系，將為相關(guān)病毒的分離培養(yǎng)提供新的細胞系選擇.

仔豬腎細胞；原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)；細胞

目前，廣泛用于動物病毒培養(yǎng)的細胞系主要是引進外國建立的細胞株，這些舊的細胞系在應用中出現(xiàn)了不少問題，研究的發(fā)展迫切期待新的、敏感性更高、適應性更好細胞系的誕生.一方面，常用傳統(tǒng)細胞系已經(jīng)過幾十年的傳代，發(fā)生了一些變異，如細胞形態(tài)、核型、生產(chǎn)速率、產(chǎn)酸率等，導致對病毒的敏感性發(fā)生了變化.另一方面，動物病毒在新的生物環(huán)境下不斷的發(fā)生變異，對已有細胞系的敏感性下降，造成培養(yǎng)難度加大，培養(yǎng)的病毒滴度低等.本研究選擇當前飼養(yǎng)面廣、飼養(yǎng)量大的現(xiàn)代雜交商品豬仔豬為原始材料，利用細胞培養(yǎng)技術(shù)篩選培育出一株仔豬腎細胞系，命名為SDPK-D.該SDPK-D細胞系是針對現(xiàn)代商品豬特意培育的新的細胞系，將為相關(guān)動物病毒的分離培養(yǎng)提供新的選擇.

1　材料與方法

1.1主要材料與儀器

材料：新生仔豬來自韶關(guān)某豬場；1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；水解乳蛋白購自BIOSHARP；胰蛋白酶購自AMRESCO公司；青、鏈霉素購自哈爾濱制藥六廠；胎牛血清購自天杭生物科技有限公司；DNA提取試劑、PCR擴增酶試劑、DNA分子量標準等購自大連寶生物有限公司；檢測引物由大連寶生物有限公司合成.

儀器：AC2-4S1Ⅱ型生物安全柜，Esco公司；DMI 3000B倒置顯微鏡，Leica公司；311恒溫CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司；SKFG-01B鼓風干燥箱，上海精風儀器廠；PTC-200 DNA擴增儀，MJ公司；CLASSICUVF超純水儀器，ELGA公司；MLS-3750全自動高壓滅菌鍋，三洋公司.

1.2仔豬腎細胞的原代培養(yǎng)

取初生至幾天齡仔豬，頸動脈放血致死，用7%新潔爾滅溶液進行消毒，在生物安全柜中進行無菌操作，取下仔豬的左右腎，剝離腎包膜，將纖維組織較多的髓質(zhì)部棄去，把皮質(zhì)部剪成直徑約為2 mm的小塊，用各含1 μ/mL青霉素和鏈霉素的PBS液沖洗3～4次，將血凝塊和紅細胞等除去，繼續(xù)將皮質(zhì)小塊剪碎成盡可能小的組織塊，再次沖洗3～4次.向其中加入0.25%胰酶溶液，于37℃水浴消化，至發(fā)現(xiàn)組織塊上有白色絮狀物時棄去胰酶，加入含10%血清的水解乳蛋白-Hanks液終止消化，用6層紗布進行過濾，將濾液分裝在玻璃細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).次日起，視酸堿度改變決定換液量，細胞生長少的瓶，進行半量營養(yǎng)液，細胞生長多的瓶則全部換新營養(yǎng)液，一般營養(yǎng)液維持在pH 7.1～7.2的范圍［1-2］.

1.3仔豬腎細胞的傳代培養(yǎng)

當細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底達到80%以上的面積，進行傳代培養(yǎng).將瓶塞打開，用玻璃吸管吸去舊的營養(yǎng)液，加入約5 mL滅菌PBS液沖洗細胞表面3次，清除殘存營養(yǎng)液，然后繼續(xù)用玻璃吸管吸取.最后加入0.5 mL 0.25%胰酶，加塞，靜置觀察，讓細胞層逐步脫落.當部分或大部分細胞已脫落時，打開瓶塞，加入10 mL營養(yǎng)液，用吸管作5～20次沖散操作，制成細胞懸液.用吸管取一半含有細胞的營養(yǎng)液的細胞懸液轉(zhuǎn)移到一個新的細胞瓶作為傳代，另一半量則留在原瓶中.新、舊瓶加蓋后，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).

每次傳代后，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)30～50 min，然后鏡下觀察細胞貼壁情況，取出并輕微振蕩細胞瓶，用吸管將未貼壁細胞懸液吸出接種到另一個培養(yǎng)瓶內(nèi)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).每次傳代均如此處理，純化上皮細胞，直至在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)接近上皮樣，而非雜亂的多形態(tài)細胞.

1.4仔豬腎細胞系生長曲線和細胞活率的測定

用含9%牛血清營養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，待細胞長至對數(shù)生長期，胰酶消化制成細胞懸液，稀釋10倍后進行計數(shù).根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液稀釋到2×104個/mL.然后將稀釋好的細胞懸液接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).培養(yǎng)開始后，每24 h收集3孔細胞，原液計數(shù)，求3個孔細胞數(shù)的平均值，直至第8組結(jié)束.以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，細胞數(shù)目（個）為縱坐標，繪制細胞的生長曲線，并計算出細胞的倍增時間.取細胞達到增長峰值前一天所計算得到的細胞總數(shù)（Y），接種細胞數(shù)量（X）及生長時間（T）進行計算，倍增時間=T/A（式中:A=log2Y/X）.

取處于生長對數(shù)期的培養(yǎng)細胞進行臺盼藍染色，計算活細胞和死細胞數(shù)量，總細胞數(shù)不少于500個，細胞活率=活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）.

1.5細菌檢測

配置無菌肉湯培養(yǎng)基，在無菌條件下分別接種細胞懸液和大腸桿菌質(zhì)控菌株，放置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察.隨后繼續(xù)放置24 h，觀察細菌生長情況.

1.6支原體檢測

利用支原體 16S rRNA基因通用引物進行 PCR擴增.通用引物序列為：16S rRNA-forward：5'-GAACGGGTGAGTAACACGT-3'；16S rRNA-reverse：5'-GGTGTTCTTCCTAATATCTACG-3'.PCR反應體系為20 μL，其中2×Taq Mixture10 μL，Primers（10 μmol/L）各0.8 μL，支原體DNA模板3.0 μL，去離子水5.4 μL.PCR反應程序如下：94℃預變性10 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min.

2　結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)細胞形態(tài)變化

原代細胞懸液接種細胞瓶后的8～12h可見部分貼壁，貼壁的細胞周圍有上皮細胞生長；貼壁后2d左右，顯微鏡下可以觀察到有少量成纖維細胞成放射狀生長；3～5d貼壁生長的細胞逐漸增多，且趨于匯合，并呈界限明顯或者不明顯的片狀、放射狀、流水狀生長狀況.原代培養(yǎng)的細胞形態(tài)較多樣，有呈梭形、三角形、立方形、不規(guī)則形等.

2.2傳代細胞培育過程中的形態(tài)變化

在本細胞系的培育過程中，細胞形態(tài)出現(xiàn)了三個階段的變化.第一階段，最初的培養(yǎng)物中有一般原代細胞培養(yǎng)物中見到的近方形的、排列比較緊密的類上皮細胞，疏松的紡錘狀或星狀的纖維母細胞（見圖1和2）；第二階段，細胞代次停留在第7～10代之間.肉眼可以看見圓形的互不相連的類上皮細胞集落，在顯微鏡下細胞呈一定的平行排列.第三階段，為第15代左右，個別細胞培養(yǎng)瓶出現(xiàn)比其他細胞顯得發(fā)亮、生長較快的新型細胞.新型細胞的排列無定向，細胞集落相遇后繼續(xù)生長，逐步融合在一起，這些細胞逐步代替了其他細胞，最后連成一片的類上皮型細胞培養(yǎng)物了.隨后的培育過程中，細胞形態(tài)穩(wěn)定，絕大部分呈現(xiàn)梭形、多角形，且細胞大小均勻，生長速度較快，第三至四天可以形成細胞蔟，第五天基本達到90%覆蓋單層（見圖3和4）.

圖1　原代細胞培養(yǎng)40h形態(tài)（×400）

圖2　原代細胞培養(yǎng)第五天細胞形態(tài)（×400）

圖3　第20代細胞40h形態(tài)（×400）

圖4　第20代細胞第五天形態(tài)（×400）

2.3傳代細胞培育過程中速度變化

以SDPK-D細胞各代次每瓶第一次傳代所需平均日數(shù)為細胞生長速度的指標，即日數(shù)越多生長越慢，第1～5代細胞生長速度與初分離出的細胞生長速度相對較快，到了第6代生長速度變慢，這時大部分細胞瓶內(nèi)的大部分細胞都相繼發(fā)生死亡，能作傳代的細胞與第一次傳代所需時間比第5代增加了.到第8代左右可以分為兩個發(fā)展很不同的方向，其中出現(xiàn)一個細胞瓶以上皮細胞為優(yōu)勢群的新型細胞生長速度較慢，另一個細胞瓶以成纖維細胞為優(yōu)勢群的細胞生長速度較快.隨后細胞繼代均能順利進行，而且其生長速度保持穩(wěn)定.從第15代開始，細胞形態(tài)和大小等基本處于平穩(wěn)狀態(tài).

2.4細胞生長曲線的測定和活率

本實驗選擇了第33代細胞為生長曲線測定目標.連續(xù)8天進行細胞計數(shù)，結(jié)果見表1.測定細胞倍增時間為40.5 h，細胞活率能達到97.55%.根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，繪制該第33代培養(yǎng)物生長曲線圖（見圖5）.

表1　SDPK-D生長細胞計數(shù)

2.5細菌檢測和支原體檢測

進行的細菌檢測結(jié)果表明，培育細胞懸液組，無細菌、真菌污染，在不含雙抗的培養(yǎng)基中，細胞生長狀況良好，培養(yǎng)基保持明亮清澈；而陽性對照組，培養(yǎng)基變渾濁，在顯微鏡下觀察可以見到明顯的細菌活動.

進行的支原體檢測結(jié)果表明，細胞中均未檢測出支原體核酸，見圖6.

圖5　SDPK-D細胞生長曲線圖

3　討論

傳統(tǒng)的腎上皮細胞的分離方法包括組織塊法、消化法等.一般情況下，組織塊法較難控制成纖維細胞的生長，已經(jīng)被淘汰.現(xiàn)在學者們大多采用消化法，而常用的用來消化的生物酶有胰酶、膠原酶，膠原酶又分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型和肝細胞專用膠原酶［3］.研究采用胰酶消化以及差速貼壁相結(jié)合的方法分離純化豬腎上皮細胞，取得了較好的效果.

從原代細胞中選育、分離培養(yǎng)出高純度的腎上皮細是本研究的目的.選擇培育腎上皮細胞為目標，朝著兩個方向?qū)毎M行選育.第一是在形態(tài)上選擇類上皮細胞樣的細胞為主，第二是選擇的細胞具有良好的貼壁性.原代細胞株順利地轉(zhuǎn)變?yōu)閭鞔毎档南嚓P(guān)報道極少，一般需要加以特別的培育［4］.生物的變異是通過許多世代交替實現(xiàn)的一種緩慢的、且不可避免的動態(tài)過程.只要能使細胞存活并且進行繁殖就能使其發(fā)生變異而成為傳代細胞系.通常采用的傳代細胞系培育途徑，就是等待原代細胞株傳代到生長顯著衰退之前停止繼代，只作經(jīng)常換液，等待出現(xiàn)逐步占優(yōu)勢的變異細胞生勢下降到極點，再出現(xiàn)回升是原代細胞株發(fā)生變異而成為傳代細胞系主要標志［5］.本實驗培育傳代細胞系至第33代的研究工作就集中在這8、9個月里.細胞歷經(jīng)傳代變異，達到形態(tài)、生長速度基本穩(wěn)定.

圖6　支原體檢測結(jié)果

細胞系育成的過程中，雖然沒有作詳細的測量，大部分細胞瓶內(nèi)的細胞均生長很慢而最終死亡，在生勢衰退的原代細胞株的細胞群體中出現(xiàn)了生長速度穩(wěn)定、貼壁性好的細胞群體.通過有目的的選育上皮細胞，同時采取兩個辦法：一是傳代時保留原瓶，二是做原代培養(yǎng)時使用水解乳蛋白液-Hanks液為培養(yǎng)基進行小瓶培養(yǎng).在第8代細胞培養(yǎng)物中，有一些變異的細胞，形態(tài)類上皮樣，成一塊生長，細胞貼壁型明顯優(yōu)于其他部位的細胞，但數(shù)量不大，生長較慢.因為細胞的貼壁性非常重要，只有足夠數(shù)量的細胞迅速貼在培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上，才會開始積極代謝而合成非必需氨基酸等有用物質(zhì).而原瓶內(nèi)已存在未脫落的細胞，它們可以馬上生產(chǎn)有用的代謝產(chǎn)物，水解乳蛋白液Hanks液中的葡萄糖和磷酸鹽起反應產(chǎn)生了促進貼壁的物質(zhì)，玻璃材質(zhì)的細胞瓶內(nèi)壁有利于細胞的貼附［4］.該細胞系從第15代到33代的細胞均處于較穩(wěn)定的狀況，而第33代細胞生長曲線的測定也證實了本試驗做出的判段.

無菌操作對于細胞培養(yǎng)至關(guān)重要，在細胞培養(yǎng)過程中應該高度重視無菌原則，尤其注意以下幾個方面，一是相關(guān)試劑的配置要符合無菌操作要求，二是所有器皿均必須認真清洗和充分消毒，三是所有樣品進入無菌間和生物安全柜前都應該用75%的酒精棉球或新潔爾滅擦拭，實驗過程中每一步操作都應嚴格遵循實驗原則和無菌要求［6］.

4　展望

一般情況下，從動物體分離的細胞，一般能夠繼續(xù)增殖，但傳代次數(shù)很有限，最終會死亡.在一定的條件或者特殊情況下，極少數(shù)細胞株能夠發(fā)生變異，成為能不斷傳代的細胞，繼而發(fā)展培育成為傳代細胞系，一方面，將繼續(xù)培育和觀察SDPK-D細胞的生長情況與狀況.另一方面，對體外培育目的細胞，除了做一般的形態(tài)學觀察，還需要進一步作免疫組化鑒定以求辨認細胞內(nèi)特定抗原，比如角蛋白、波形蛋白等.繼續(xù)將對培育的SDPK-D細胞系再做關(guān)于染色體核型、細胞類型等進一步的鑒定工作.同時將開展相關(guān)實驗證明該傳代細胞系能否感染病毒，和對不同病毒的敏感性差異等鑒定和應用工作，以求獲得一株具有新適應性、穩(wěn)定傳代的細胞系應用于相關(guān)研究，為獸用生物制品的研發(fā)提供新的、更有優(yōu)勢的素材.

［1］王東，吳雄飛，金錫御.大鼠腎小管上皮細胞的原代培養(yǎng)及傳代［J］.中華實驗外科雜志，1999，3（2）:179-180.

［2］鄂征.組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)［M］.北京:北京出版社，1994.

［3］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細胞培養(yǎng)［M］.北京:世界圖書出版公司，2001.

［4］劉福安.幼豬腎BPK（Ⅳ）傳代細胞系培育的研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，1979（10）:1-4.

［5］周峰，杜賢進，董長垣，等.原代腎上皮細胞改良培養(yǎng)方法［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（11）:2101-2104.

［6］王獻偉，盧晟盛，盧克煥.新生廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞體外培養(yǎng)體系的建立［J］.中國獸醫(yī)學報，2011，31（10）:1526-1532.

Cultivation of a Modern Commercial Piglet Kidney Cell Line

HU Hong-hui，YU Wen-tao，HUANG Jian-qiang，NAN Wen-jin，WU Jing-bo
（Animal Disease Lab，Assets and Lab Department，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

By trypsin digestion and differential velocity adherent combination method，the experiment separated and purificated some porcine kidney epithelial cells，and continuously subcultured them in vitro.At last，it got a strain named SDPK-D which could be serially passaged.SDPK-D is a new cultivated cell line from modern commercial pig for the first time，providing a new selection for the isolation and culture of virus.

piglet kidney cell；primary culture；subculture；cell

S8

A

1007-5348（2016）06-0053-05

（責任編輯：閆文龍）

2016-05-10

廣東省協(xié)同創(chuàng)新平臺項目（YJK-2014-52-16）；韶關(guān)市科技計劃項目（2013CX/NO6，韶科［2015］72號）.

胡鴻惠（1982-），女，湖南郴州人，韶關(guān)學院資產(chǎn)與實驗室管理處動物疫病實驗室助理研究員，碩士；研究方向：動物生產(chǎn)與疾病控制.