張義敏，　李萍，　田明濤，　唐承

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南　250355；2.威海市胸科醫(yī)院，山東威?！?64200）

β-欖香烯干預(yù)人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究

張義敏1，2，李萍2，田明濤2，唐承2

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.威海市胸科醫(yī)院，山東威海264200）

【目的】通過觀察不同濃度β-欖香烯作用于體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞的產(chǎn)生的差異性蛋白質(zhì)表達(dá)，篩選β-欖香烯防治肝癌的作用靶點(diǎn)。【方法】于體外常規(guī)條件下，以0、10、30 μg/mL β-欖香烯培養(yǎng)基孵育人肝細(xì)胞癌HepG2 24 h，提取蛋白質(zhì)后采用十二烷基硫酰鈉—聚丙烯酸胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）分離蛋白，選取表達(dá)量升高或降低3倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，隨后運(yùn)用Protein Chip PBS1j-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀將其檢測繪制成蛋白質(zhì)質(zhì)譜。使用GPS Explore V 3.6軟件對所有蛋白質(zhì)質(zhì)譜進(jìn)行分析，并通過MASCOT V 2.1搜庫軟件進(jìn)行檢索，以鑒定蛋白質(zhì)質(zhì)點(diǎn)?！窘Y(jié)果】通過對β-欖香烯處理前后肝癌HepG2細(xì)胞蛋白雙向凝膠電泳圖譜分析，共得到91個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。選擇表達(dá)量差異明顯的53個蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)9個，其中表達(dá)上調(diào)3個，分別是UBE2V1、SF1、Annexin V；表達(dá)下調(diào)6個，分別是β-Actin、S100A6、HSP70、Keratin4、FUBP1、Keratin18?！窘Y(jié)論】β-欖香烯可影響人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)，這些蛋白質(zhì)可能是β-欖香烯防治肝癌的作用靶點(diǎn)。

β-欖香烯；肝癌；蛋白質(zhì)組學(xué)；HepG2

原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病之一。目前原發(fā)性肝癌的治療以手術(shù)為主［1］，但對于特殊部位或者晚期患者，仍缺乏有效的治療手段。近年來，研究者們從中國傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)了一些具有抗腫瘤活性的有效成分，中藥有效成分抗腫瘤研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2］。

莪術(shù)是我國姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)或溫郁金的干燥根莖，是常用的活血化瘀藥物，具有行氣破血、消積止痛的功效，可用于治療癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛［3］。現(xiàn)代藥理研究［4］證實(shí)，莪術(shù)具有很好的抗腫瘤作用。β-欖香烯（β-elemene）是溫莪術(shù)根莖提取物，是一種只含碳、氫2種元素組成的倍半萜烯類化合物，臨床上為治療惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其他淺表性腫瘤的潛在新藥，具有很強(qiáng)的殺滅腫瘤細(xì)胞及抑制腫瘤生長作用［5］。既往研究［6］發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯具有抑制體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞增殖的作用，但是其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本研究通過觀察β-欖香烯對體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，篩選β-欖香烯防治肝癌的作用靶點(diǎn)，以期闡明β-欖香烯防治肝癌的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1試劑與儀器人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生化所細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清均購自美國GibcoBrl公司；β-欖香烯購自中國藥品生物制品檢定所（批號：100268-200401，純度≥98%）。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（DTT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Nuclease Mix購自美國 Sigma公司；固相 pH梯度干膠條（IPGstrip pH=3～10NL，L=13 cm）、immobilized pHgradient（IPG）緩沖液（Ph3～10NL）、覆蓋液、蛋白銀染試劑盒均由美國GE公司生產(chǎn)；四甲基乙二磺（Temed）、3-［（3-膽酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸（CHAPS）、Electrophoresis Regent（T9281）購自美國Simga公司。IPGphor等電聚焦儀由Pharmacia公司生產(chǎn)；ImageMaster2D platinum凝膠成像系統(tǒng)、ImageScannerⅢ掃描儀、PDQest 7.4分析軟件、EXQuest全自動酶切系統(tǒng)、MODEL 680 Microplate Reader酶標(biāo)儀均購自美國 Bio-Rad公司；MALDI-TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Image Master 6.0雙向凝膠圖譜分析軟件購自美國GE公司。Mascot Distiller質(zhì)譜信號峰識別軟件、Mascot肽質(zhì)量指紋圖數(shù)據(jù)庫查詢軟件及Mascot數(shù)據(jù)庫查詢軟件購自美國Matrix science公司。所有溶液均用Milli Q水（美國Milli-pore公司產(chǎn)品）制備。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下，在飽和濕度無菌培養(yǎng)箱中使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌HepG2；當(dāng)HepG2細(xì)胞生長至融合90%左右時，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)本研究前期研究結(jié)果，β-欖香烯對HepG2細(xì)胞24 h的半數(shù)致死量（IC50）為23.5 μg/mL，故本研究分為3組，即A組（空白對照組）：含（體積分?jǐn)?shù)，下同）10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組：含10%胎牛血清+10 μg/mL β-欖香烯的RPMI-1640培養(yǎng)基組；C組：含10%胎牛血清+30 μg/mL β-欖香烯的RPMI-1640培養(yǎng)基組。3組細(xì)胞均于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下在飽和濕度無菌培養(yǎng)箱中孵育24 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4蛋白提取將各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)上清液，采用細(xì)胞收集器收集生長至80%融合的細(xì)胞，用預(yù)冷的D-Hanks洗3次，300×g離心5 min；棄上清液后加入細(xì)胞裂解液，冰浴30min，16000×g，4℃離心5 min；棄細(xì)胞殘屑，上清液即為細(xì)胞蛋白提取物。采用Bradford法［7］測定蛋白質(zhì)濃度，以胎牛血清白蛋白（BSA）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5雙向凝膠電泳參考IPGphor等電聚焦系統(tǒng)指南的方法進(jìn)行雙向凝膠電泳，細(xì)胞蛋白上樣量為500 μg，IPG干膠條水化與等電聚焦均在20℃的條件下開展。第一向等電聚焦（IEF）結(jié)束后經(jīng)過平衡再進(jìn)行第二向垂直板十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。停止電泳后，取出雙向凝膠（2-DE）進(jìn)行銀染色［8］。然后采用Image Master 2D platinum凝膠成像系統(tǒng)掃描銀染顯色的凝膠，PDQuest 7.4圖像分析軟件對圖像進(jìn)行強(qiáng)度校正、過濾、擬合、點(diǎn)檢測、背景消減、均一化和匹配等分析。

1.6酶解與質(zhì)譜鑒定選取染色后具有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行脫色、酶解、萃取等，取上清液用ZIPTIPTMC18微柱進(jìn)行脫鹽；然后與5 mg/mL α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)液混合，在384孔不銹鋼板上，取0.4 μL樣品點(diǎn)于點(diǎn)樣鋼板上；然后取0.4 μL5 mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸二乙胺鹽（CHCA）基質(zhì)溶液于樣品點(diǎn)上，自然風(fēng)干以后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。用MALDI-TOF/TOF儀進(jìn)行分析，取Nd：YAG激光器（355 nm波長），采用正離子和自動獲取數(shù)據(jù)模式采集數(shù)據(jù)。獲得的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore V 3.6軟件進(jìn)行分析，分析后的每一個樣品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個文件，使用MASCOT V 2.1搜庫軟件對本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，鑒定蛋白質(zhì)；數(shù)據(jù)庫為IPI HumandatabaseV3.36， 物 種 為Homo sapiens （human），切割的酶為trypsin，允許最大的未被酶切位點(diǎn)數(shù)為1，可變修飾為半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化。母離子質(zhì)量容差為30～60 ppm，片段離子質(zhì)量容差為0.2～0.3 Da。蛋白質(zhì)的鑒定和質(zhì)譜評分結(jié)果，及肽段匹配信息分析等均以MASCOT為搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫搜索。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的β-欖香烯作用于HepG2細(xì)胞后的2-DE電泳圖圖1結(jié)果顯示：以0、10、30 μg/mL 的β-欖香烯處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h，提取蛋白，進(jìn)行蛋白雙向凝膠電泳圖譜分析后，分別將10 μg/mL組、30 μg/mL組與空白對照組（0 μg/mL組）比較；將30 μg/mL組與10 μg/mL組比較，共得到91個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；選取其中表達(dá)差異率3倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為差異點(diǎn)，共53個蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析；最終得到有意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)9個。

2.2質(zhì)譜鑒定結(jié)果表1結(jié)果顯示的是所得到的9個有意義差異蛋白質(zhì)經(jīng)過NCBInr數(shù)據(jù)庫檢索之后的名稱、理論分子量、等電點(diǎn)等屬性。這9個蛋白質(zhì)為分別是β肌動蛋白（β-Actin）、泛素結(jié)合酶E2變異體1（UBE2V1）、重組人S100鈣結(jié)合蛋白A6（S100A6）、熱休克蛋白70（HSP70）、角蛋白4（Keratin4）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）、剪接因子1（SF1）、角蛋白18（Keratin18）、DNA遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1（FUBP1）。其中 UBE2V1、S100A6、HSP70為30 μg/mL組與10 μg/mL組比較得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，SF1、FUBP1、Keratin4、Annexin V為30 μg/mL組與空白對照組比較得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，β-Actin和Keratin18為10 μg/mL與空白對照組比較得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。隨著β-欖香烯濃度升高表達(dá)上調(diào)的3個蛋白質(zhì)，分別是UBE2V1、SF1、Annexin V；隨著β-欖香烯濃度升高表達(dá)下調(diào)的 6個蛋白質(zhì)，分別是 β-Actin、S100A6、HSP70、Keratin4、FUBP1、Keratin18。

圖1　不同濃度的β-欖香烯作用于HepG2細(xì)胞后的2-DE電泳圖Figure 1 Two-dimensional gel electrophoresis results for the effect of different concentrations of β-elemene on HepG2

表1　β-欖香烯處理前后HepG2細(xì)胞差異蛋白質(zhì)表達(dá)Table 1　Differential-protein expression in HepG2 before and after treatment with β-elemene

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能夠調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，這些差異蛋白表達(dá)不僅驗(yàn)證了體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果，而且預(yù)測了可能存在的抗肝癌的作用機(jī)制。以下對所得到的9個蛋白質(zhì)進(jìn)行簡要討論。

UBE2V1對核轉(zhuǎn)錄因子（NK-κB）信號傳導(dǎo)通路的活化調(diào)控至關(guān)重要，能夠介導(dǎo)NK-κB靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，在細(xì)胞凋亡、生長抑制、抑制細(xì)胞周期和分化進(jìn)程及DNA修復(fù)過程中具有重要作用，有助于細(xì)胞DNA損傷后的修復(fù)［9-10］。本研究中β-欖香烯可以上調(diào)UBE2V1的表達(dá)，從而使NK-κB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，阻止腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，并能誘導(dǎo)正常細(xì)胞的修復(fù)。

SF1是參與RNA前體剪接過程的蛋白質(zhì)因子，可以通過抑制剪接因子，達(dá)到抑制剪接反應(yīng)、阻礙RNA的成熟以及影響細(xì)胞代謝及生長的目的，這可能是腫瘤治療的一個新的方向［11］。本研究結(jié)果表明：β-欖香烯能夠上調(diào)SF1表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Annexin V是一種人內(nèi)源性蛋白，能與凋亡細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，具有抗凝、抗炎作用，還具有抑制腫瘤血管新生和腫瘤生長的作用［12］。本研究結(jié)果表明：β-欖香烯可上調(diào)Annexin V表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤血管新生的作用。

β-Actin是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分，它在細(xì)胞分泌、吞噬、移動、胞質(zhì)流動和胞質(zhì)分離等過程中起重要作用［13］。在本研究中，β-Actin是β-欖香烯作用于HepG2細(xì)胞的靶向蛋白之一。

S100A6是S100鈣結(jié)合蛋白家族的重要成員，在多種腫瘤組織中均有表達(dá)增高現(xiàn)象，其異常表達(dá)與細(xì)胞的增殖、分化以及侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［14］，因此是生物治療及危險性預(yù)測的靶分子［15］。本研究結(jié)果顯示：β-欖香烯能夠抑制S100A6的表達(dá)。

HSP70是熱休克蛋白家族中最重要、最保守的成員，細(xì)胞應(yīng)激后其反應(yīng)最明顯，其在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)，與大部分腫瘤細(xì)胞低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞耐藥等方面關(guān)系密切［16］。韓大躍等［17］研究表明，欖香烯對肝癌細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。本研究中，β-欖香烯具有下調(diào)HSP70表達(dá)的作用，提示β-欖香烯可能通過抑制肝癌HepG2細(xì)胞中HSP70高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

FUBP1與細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子關(guān)系密切，是影響多種腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要腫瘤蛋白，其作為遠(yuǎn)端上游元件的結(jié)合因子，參與對原癌基因c-myc表達(dá)的調(diào)節(jié)［18］。Rabenhorst等［19］發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的生長必須依賴FUBP1的過表達(dá)。本研究結(jié)果顯示：通過β-欖香烯具有下調(diào)FUBP1表達(dá)的作用，可能是肝癌細(xì)胞惡性增殖的原因之一。

Keratin4、Keratin18均屬于細(xì)胞角蛋白家族，是上皮細(xì)胞骨架成分，其在非單層上皮性腫瘤的分化和發(fā)展過程中異常表達(dá)，可增加腫瘤細(xì)胞的遷移性和浸潤性［20］。Keratin已成為肝癌、胃癌等多種腫瘤診斷、分期和藥效評價的重要指標(biāo)［21］。本研究中，β-欖香烯可以下調(diào)Keratin4、Keratin18表達(dá)，提示β-欖香烯可能通過下調(diào)Keratin4、Keratin18表達(dá)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

總之，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究β-欖香烯干預(yù)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)，結(jié)果提示β-欖香烯可以影響肝癌細(xì)胞多種蛋白質(zhì)表達(dá)，這些差異表達(dá)蛋白可能是β-欖香烯抑制肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制。但是，本研究僅為體外細(xì)胞研究，結(jié)果有一定的局限性，仍需進(jìn)一步探討更為確切的作用機(jī)制。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Proteomics Research of Intervention Effect of β-elemene on Human Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells

ZHANG Yimin1，2，LI Ping2，TIAN Mingtao2，TANG Cheng2
（1.ShandongUniversityof Traditional ChineseMedicine，Jinan250355Shandong，China；2.Weihai Chest Hospital，Weihai264200Shandong，China）

ObjectiveTo screen the targets of β-elemene in preventing and treating hepatocellular carcinoma through observing differential protein expression of hepatocellular carcinoma HepG2 cells after intervention with different concentrations of β-elemene.Methods After intervention with culture medium containing 0，10，30 μg/mL of β-elemene for 24h，proteins of HepG2 cells were extracted and isolated with two-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）method.The protein spots having the expression amount increasing or decreasing by more than 3 times were selected for mass spectrum identification，and then Protein Chip PBS1j-Ctype protein chip reader was used to detect and map the mass spectrogram of the proteins.After all the protein mass spectra were analyzed with Explore V3.6 GPS software，and the protein spots were identified through retrieving the local database with MASCOT V2.1 search software.Results The results of SDS-PAGE showed that 91 differential-protein spots were obtained after analyzing the electrophoresis map.After mass spectrum identification of 53 protein spots with obviously differential expression，we obtained 9 protein spots having statistical significance in protein differential expression.Ofthe 9 protein spots，up-regulated expression was shown in 3 protein spots，and theywere UBE2V1，Splicing Factor1，and FUBP1；down-regulated expression was shown in 6 protein spots，and they were β-Actin，S100A6，HSP70，Keratin4，Annexin V，and Keratin18.Conclusion β-elemene has an intervention effect on protein expression of hepatocellular carcinoma HepG2 cells，and the protein spots having statistical significance in protein differential expression probably are the target points.

β-elemene；hepatocellular carcinoma；proteomics；hepatocellular carcinoma（HepG2）

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0565-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.028

2015-12-18

張義敏（1981-），女，在讀博士研究生，主治醫(yī)師；E-mail：zhangyiminzym@hotmail.com

唐承，男，主治醫(yī)師；E-mail：tangcheng968@126.com