栗昀，　賴艷妮，　李向陽，　徐培平

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州　510405）

冰香散揮發(fā)油黏膜免疫抗流感病毒效果評(píng)價(jià)

栗昀，賴艷妮，李向陽，徐培平

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

【目的】評(píng)價(jià)冰香散揮發(fā)油抗流感病毒黏膜免疫的效果。【方法】將30只BABL/c小鼠分為正常對(duì)照組、安慰劑組、以及冰香散揮發(fā)油組，每組10只。提前7 d預(yù)防給藥，正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)，安慰劑組（體積分?jǐn)?shù)為1%吐溫-80）灌胃給藥（1 mL/d），冰香散揮發(fā)油組滴鼻給藥（0.05 mL/d），以5倍半數(shù)致死量（5LD50）流感病毒液A/FM/1/47（H1N1）滴鼻感染小鼠，建立病毒性肺炎小鼠模型。之后連續(xù)觀察5 d，眼球摘除取血，收集鼻黏膜、支氣管肺泡灌洗液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)IgA、IgG、分泌型IgA（s-IgA）含量；分離鼻相關(guān)淋巴組織，采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定CD4、CD8表達(dá)；收集脾淋巴細(xì)胞，以刀豆蛋白（ConA）和脂多糖（LPS）刺激，采用細(xì)胞增殖與活性試劑盒（CCK-8）檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況；采用ELISA檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）水平?！窘Y(jié)果】冰香散揮發(fā)油組能提高灌洗液s-IgA和血清IgA水平，提高血清IgG含量，刺激CD4+、CD8+T細(xì)胞分化與成熟，刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，刺激細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4分泌，與安慰劑組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）?！窘Y(jié)論】冰香散揮發(fā)油滴鼻免疫能夠有效地誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，引起體液免疫和細(xì)胞免疫，發(fā)揮抗病毒作用。

冰香散揮發(fā)油；流感病毒；黏膜免疫；疾病模型，動(dòng)物；小鼠

流感主要是由流感病毒引起的呼吸道傳染病。近年來，由于流感病毒抗原的變異，出現(xiàn)高致病性的禽流感在人類的傳播導(dǎo)致感染人數(shù)和死亡人數(shù)不斷增多［1］。流感病毒通過飛沫傳播，侵襲呼吸道黏膜。呼吸道黏膜免疫作為第一道免疫屏障在抵抗流感病毒感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。病毒感染之初，黏膜上的病毒載量較低，在此阻斷病毒的侵襲是抑制流感病毒復(fù)制的有效手段［2］。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在預(yù)防流行病方面發(fā)揮著重要作用。藿香、冰片等藥物廣泛用于預(yù)防和治療流行?。?］。本研究通過以冰香散揮發(fā)油滴鼻預(yù)防給藥，檢測(cè)流感病毒模型小鼠體內(nèi)免疫水平，探討冰香散揮發(fā)油抗流感病毒的免疫機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及病毒株40只SPF級(jí)BABL/c小鼠，雌性，體質(zhì)量是13～15 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中心，合格證號(hào)：SCXK（粵）20132-2014；流感病毒A/FM/1/47（H1N1）鼠肺適應(yīng)株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒實(shí)驗(yàn)室雞胚擴(kuò)種后于-80℃冷凍保存。

1.2藥物以及試劑冰香散（冰片、廣藿香等）購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，藥物制劑以及提取參考文獻(xiàn)［4］；利巴韋林（病毒唑）注射液購(gòu)自辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H19993512；吐溫-80購(gòu)自天津大茂（批號(hào)：20120110）；小鼠分泌型免疫球蛋白A（s-IgA）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：CSB-E08413m）、小鼠干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：CSB-E08212）、小鼠白細(xì)胞介素-4（IL-4）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：CSB-E08732）均購(gòu)自美國(guó)Cusabio公司；淋巴細(xì)胞分離液（批號(hào)：DKW33-R0100）購(gòu)自美國(guó)深圳達(dá)可為生物技術(shù)有限公司；小鼠免疫球蛋白G（IgG）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)：EK-271-20151224）購(gòu)自聯(lián)科生物公司；CD4抗體（批號(hào)：980809）、CD8抗體（批號(hào)：YE0381W）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；刀豆蛋白（ConA）和 脂多糖（LPS）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（批號(hào)：120721）以及1640培養(yǎng)基（批號(hào)：131946）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞增殖與活性試劑盒（CCK-8）（批號(hào)：GX609）購(gòu)自碧云天公司。

1.4動(dòng)物分組及給藥將30只BABL/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、安慰劑組、冰香散揮發(fā)油組，按照本實(shí)驗(yàn)室建立的流感病毒感染模型方法進(jìn)行造模［5］。提前7 d預(yù)防給藥，安慰劑組灌胃給藥（體積分?jǐn)?shù)1%吐溫-80—生理鹽水）1 mL/d，冰香散揮發(fā)油組滴鼻給藥（劑量為0.05 mL/d），正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)。連續(xù)給藥7 d后，乙醚輕度麻醉小鼠，以5倍半數(shù)致死量（5LD50）流感病毒50 μL滴鼻感染小鼠，連續(xù)觀察5 d，處死小鼠，采集標(biāo)本。

1.5血清lgA、IgG檢測(cè)摘除眼球采血，收集血液，室溫放置30 min以上，2 000 r/min，離心20 min，收集血清，-20℃保存。

1.6肺泡灌洗液以及鼻黏膜s-IgA檢測(cè)處死小鼠，分離氣管，用1 mL針管從氣管上端向肺組織注射無菌生理鹽水，回抽清洗液，每次2 mL，分2次沖洗。同法從氣管向鼻部注射生理鹽水，收集鼻黏膜沖洗液。

1.7鼻相關(guān)淋巴組織CD4、CD8表達(dá)常規(guī)分離鼻相關(guān)淋巴組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。以體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定至少24 h，脫水，石蠟包埋，脫蠟，抗原修復(fù)，內(nèi)源性酶滅活；加入一抗、二抗，之后加入顯色劑，判讀，以積分光密度值（IOD）表示CD4、CD8的表達(dá)水平。

1.8脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)無菌條件下摘取小鼠脾臟，在淋巴細(xì)胞分離液中，用滅菌的尼龍網(wǎng)碾磨脾臟，收集分離液，離心；收集淋巴細(xì)胞，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，每孔加入100 μL淋巴細(xì)胞懸液（5×106/mL），用10 μg/mL的ConA或者是 LPS刺激，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)淋巴細(xì)胞48 h，之后加入10 μL CCK-8培育4 h，在490 nm處測(cè)定吸光度。

1.9細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4檢測(cè)收集淋巴細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（5×106/mL），每孔加入100 μL，以10 μg/mL ConA刺激，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒的操作要求進(jìn)行操作。

1.10統(tǒng)計(jì)方法用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行多組數(shù)據(jù)計(jì)量資料單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組對(duì)IgA、IgG、s-IgA含量的影響表1結(jié)果顯示：與安慰劑組比較，冰香散揮發(fā)油組能顯著提高灌洗液s-IgA、血清IgA和IgG含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　冰香散揮發(fā)油對(duì)lgA、lgG、s-lgA含量的影響Table 1　Effects of Bingxiang San volatile oil on the contents of lgA，lgG and s-lgA　（±s）

表1　冰香散揮發(fā)油對(duì)lgA、lgG、s-lgA含量的影響Table 1　Effects of Bingxiang San volatile oil on the contents of lgA，lgG and s-lgA?。ā纒）

①P＜0.05，②P＜0.01，與安慰劑組比較

組別　N　ρs-lgA/（pg·mL-1）　ρ血清/（pg·mL-1）正常對(duì)照組安慰劑組冰香散揮發(fā)油組5 5 5支氣管肺泡灌洗液-8.19±1.68 9.99±2.47①鼻黏膜沖洗液-0.33±0.1 0.55±0.38①lgA -1.74±0.42 2.45±0.66②lgG -13.2±3.6 19.6±3.3①

2.2各組對(duì)CD4+、CD8+細(xì)胞的影響圖1結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，冰香散揮發(fā)油組CD4+以及CD8+細(xì)胞數(shù)量明顯增多。圖2結(jié)果顯示：安慰劑組CD4、CD8積分光密度值較正常對(duì)照組顯著升高，冰香散揮發(fā)油組CD4、CD8積分光密度值較安慰劑組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3各組對(duì)脾細(xì)胞增殖影響圖3結(jié)果顯示；經(jīng)ConA和LPS刺激，冰香散揮發(fā)油組能顯著增加脾細(xì)胞增殖，與安慰劑組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

2.4各組對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4影響圖4結(jié)果顯示：安慰劑組可顯著升高IFN-γ、IL-4的水平，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；冰香散揮發(fā)油組可顯著升高IFN-γ、IL-4水平，與安慰劑組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

除細(xì)菌等少數(shù)病原體外，包括流感病毒在內(nèi)的大部分病原體都是通過黏膜感染機(jī)體。呼吸道黏膜免疫作為第一道免疫屏障，在抵抗流感病毒感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。s-IgA是呼吸道黏膜免疫防御的主要保護(hù)因子，在引起機(jī)體局部免疫和保護(hù)呼吸道消化道黏膜中發(fā)揮著重要作用［6］。其功能表現(xiàn)在通過與呼吸道中的病原體直接結(jié)合，能夠有效地中和致病病原的毒力分子，阻礙病原體對(duì)黏膜表面的黏附，從而抑制其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引發(fā)感染［7］。流感病毒雖為細(xì)胞內(nèi)感染，但在流感病毒感染過程中所激發(fā)的體液免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。黏膜表面的s-IgA主要作用在于抵抗上呼吸道感染，而血清中IgG主要在抵抗下呼吸道感染中發(fā)揮主要作用［8］。血清中的抗體可以中和病毒，清理細(xì)菌，激活補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，限制病原體增至和擴(kuò)散，防止組織損傷［9］。此外，黏膜分泌的s-IgA是具有交叉保護(hù)作用的抗體，它能對(duì)流感病毒的不同亞型具有中和作用［8］。在臨床上，抗病毒藥物很難持久運(yùn)用的主要原因是因?yàn)椴《镜哪退幮?。耐藥毒株隨著藥物的使用會(huì)很快產(chǎn)生適應(yīng)性，阻斷病毒離子通道劑金剛烷胺和神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋均有耐藥性的報(bào)道［10-11］。因此，能夠刺激黏膜分泌大量的s-IgA 和IgG是評(píng)價(jià)抗病毒藥物效果的重要指標(biāo)。IgA分為血清型IgA和分泌型IgA（s-IgA），s-IgA分布在黏膜表面，而血清型IgA主要分布在血清中，其含量?jī)H次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的20%左右，占總IgA的85%左右，能夠介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，發(fā)揮免疫功能［12］。

圖1　冰香散揮發(fā)油對(duì)CD4+、CD8+細(xì)胞表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)法，×20）Figure 1　Effects of Bingxiang San volatile oil on the expression of CD4+and CD8+cells（by immunohistochemistry，×20）

圖2　各組CD4、CD8積分光密度值比較Figure 2　Comparison of integral optical density of CD4 and CD8 in various groups?。ā纒，n=5）

圖3　冰香散揮發(fā)油對(duì)脾細(xì)胞增殖影響Figure 3 Effects of Bingxiang San volatile oil on the proliferation of splenic lymphocytes?。ā纒，n=5）

脾臟是淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞）的定居場(chǎng)所。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫相輔相成，在抗擊流感病毒方面發(fā)揮著重要免疫調(diào)節(jié)作用［14］。鼻黏膜相關(guān)淋巴組織是流感病毒接觸以及感染的第一道防線，激活鼻黏膜相關(guān)淋巴組織對(duì)于防御和抵抗流感病毒的感染具有重要意義［14］。流感病毒進(jìn)入機(jī)體，被游離的未成熟的樹突狀細(xì)胞識(shí)別，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，進(jìn)而抗原被成熟的樹突狀細(xì)胞攝取，遞呈給T細(xì)胞和B細(xì)胞，激活T、B淋巴細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生不同的免疫反應(yīng)。激活的B細(xì)胞分化成為主要分泌抗體的漿細(xì)胞，引起體液免疫。T細(xì)胞主要分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞），兩者在控制病毒感染，減輕病變程度和死亡率方面發(fā)揮著重要作用［15］。CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2、Th17等亞型。其中，Th1產(chǎn)生細(xì)胞因子（IL-2，TNF-α，IFN-γ）能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫，Th2產(chǎn)生的細(xì)胞因子（IL-4，IL-5 和IL-10）介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和抗體亞單位的轉(zhuǎn)換［16］。細(xì)胞因子是評(píng)價(jià)免疫效果的重要的指標(biāo)，作為免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間的信使，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、清除病原體方面發(fā)揮著重要作用［17］。

圖4　冰香散揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4影響Figure 4 Effects of Bingxiang San volatile oil on IFN-γ and IL-4 levels　（±s，n=5）

冰香散揮發(fā)油滴鼻給藥，能夠有效地誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的具有交叉保護(hù)作用的s-IgA抗體；能夠刺激感染小鼠脾淋巴細(xì)胞大量增殖，促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，促進(jìn)具有抗病毒作用的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4分泌。安慰劑組中CD4和CD8表達(dá)升高，細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4分泌增多，可能與給藥方式有關(guān)，滴鼻給藥后，藥物刺激鼻黏膜，也可能引起黏膜免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出與實(shí)驗(yàn)組相似的結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冰香散揮發(fā)油滴鼻免疫具有較好的抗病毒作用，但有關(guān)黏膜免疫的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Anti-influenza Virus Effects of Bingxiang San Volatile Oil Through Mucosal Immunity

LI Yun，LAI Yanni，LI Xiangyang，XU Peiping
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo evaluate the anti-influenza virus effects of volatile oil from Bingxiang San through inducing mucosal immunity.Methods Thirty BABL/c mice were randomly divided into normal control group （receiving normal feeding），placebo group（treated with Tween-80 at volume fraction of 1%），and BingxiangSan volatile oil group（intranasal treatment with 0.05 mL/d of Bingxiang San volatile oil），10 mice in each group. BALB/c mice were pre-treated with the corresponding medicine according to the grouping for 7 days before modeling.Mice were given nasal dripping of 5-fold LD50of A/FM/1/47（H1N1）fluids to induce viral pneumonia model.General condition of mice was observed for 5 continuous days.Contents of IgA and IgG in the blood and s-lgA in nasal mucosa and bronchoalveolar lavage fluids（BALF）were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.CD4 and CD8 expression in nasal associated lymphoid tissue were determined by immunocytochemistry.Proliferation of concanavalin（ConA）-and lipopolysaccharide（LPS）-induced splenic lymphocytes was observed by cell proliferation and activity kit（CCK-8）.Cytokines of interferon gamma（INF-γ）and interleukin 4（IL-4）secreted from splenic lymphocytes were determined by enzyme-linked immuno-sorbenet assay（ELISA）.Results Bingxiang San volatile oil increased BALF and serum S-lgA level and serumlgG content（P＜0.05），promoted the differentiation and maturation of CD4+and CD8+T cells，enhanced the proliferation of splenic lymphocytes，and stimulated the secretion of cytokines IFN-γ and IL-4（P＜0.05 or P＜0.01 as compared with those of the placebo group）.Conclusion Bingxiang San volatile oil can effectively induce mucosal humoral and cellular responses to exert antivirus activity.

Bingxiang San volatile oil；influenza virus；mucosal immunity；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0535-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.022

2016-03-01

栗昀（1989-），女，碩士研究生；E-mail：857401521@qq.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81072948，81470186）；廣東省自然科學(xué)基金研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：S2012003000698）