劉海新，余　穎，湯水粉，王麗娟，羅方方

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

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氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量不確定度評(píng)定

劉海新，余穎，湯水粉，王麗娟，羅方方

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定的基本程序，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室研究建立的氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定。分析檢測(cè)過程中引入的不確定度分量，包括標(biāo)準(zhǔn)工作液、樣品稱量、樣液定容、儀器測(cè)定、樣品前處理重復(fù)性等。計(jì)算各分量結(jié)果并合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，在95%置信水平下，包含因子k=2，擴(kuò)展方法不確定度。結(jié)果表明：該檢測(cè)方法不確定度主要來源于樣品前處理過程重復(fù)性和儀器測(cè)定。因此要確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)規(guī)范操作、嚴(yán)控工作環(huán)境條件，增加平行檢測(cè)樣本數(shù)以降低檢測(cè)方法不確定度。

不確定度；丁香酚；養(yǎng)殖水體；氣相色譜質(zhì)譜

丁香酚(Eugenol)化學(xué)名為4-丙烯基-2-甲氧基苯酚，分子式為C10H12O2，廣泛存在于丁香油、肉桂葉油、樟腦油、豆蔻油等芳香油中，其藥理作用廣泛，具有麻醉、抗炎、抗過敏、抗細(xì)菌和真菌、抗氧化、促進(jìn)藥物透皮吸收等作用[1]。歐洲食品安全局(EFSA)研究表明，丁香酚具有發(fā)育毒性，根據(jù)其未觀察到不良作用水平(NOAEL)，采用100倍安全系數(shù)，制定人體食用安全限量為1.0 mg/kg·bw·day[2]。丁香酚對(duì)魚類具有麻醉作用[3-4]，其麻醉機(jī)理為首先抑制魚類的腦皮質(zhì)，使其喪失觸覺，然后作用于基底神經(jīng)節(jié)和小腦，并最終作用于脊髓達(dá)到麻醉效果[5]。丁香酚因價(jià)格低廉、高效、易于購買，而被許多魚商用于麻醉魚，以提高長途運(yùn)輸密度。目前，我國尚未批準(zhǔn)使用漁用麻醉劑，因此在運(yùn)輸水體中添加使用丁香酚并不違法，但丁香酚在流通環(huán)節(jié)潛在的風(fēng)險(xiǎn)日益受到人們的關(guān)注。水體中丁香酚檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)尚未出臺(tái)，有學(xué)者采用較昂貴的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)檢測(cè)水體中丁香酚[6]。本研究在參考該檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化提取和凈化過程、增加固相萃取凈化步驟，提高凈化效果，采用相對(duì)廉價(jià)、普及的氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)檢測(cè)，檢測(cè)方法相關(guān)性能指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

測(cè)量的不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，是對(duì)測(cè)定結(jié)果不可信程度或?qū)y(cè)定結(jié)果有效性的懷疑程度。由于被測(cè)量的真值難以準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)，因此科學(xué)合理地進(jìn)行測(cè)量結(jié)果不確定度分析，并將其應(yīng)用于測(cè)定結(jié)果評(píng)定中，對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量、降低誤判風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[7]。本文針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室研究建立的氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定水體中丁香酚含量結(jié)果，根據(jù)《CNAS-GL06化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[8]和《JJF1059.1-2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[9]規(guī)定的基本程序，同時(shí)參考水產(chǎn)品中甲基睪酮不確定度評(píng)定[10]、蘋果中多菌靈殘留量測(cè)量不確定度分析[7]、葡萄酒中山梨酸含量的不確定度的評(píng)定[11]等，對(duì)該檢測(cè)方法測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定，為科學(xué)、準(zhǔn)確、合理表述檢測(cè)結(jié)果提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

丁香酚(CAS：97-53-02)和甲基丁香酚(CAS：93-15-2)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯(色譜純)、正己烷(色譜純)：美國Tedia公司；硅膠固相萃取柱(2 g/6 mL)：德國CNW公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2儀器與設(shè)備

Thermofisher DSQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermofisher公司；電子分析天平AB204-E：瑞士梅特勒托利多公司；R206-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；TDL-40B低速臺(tái)式大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

丁香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)中間液：稱取丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg(精確至0.1 mg)，用乙酸乙酯溶解定容于100 mL容量瓶，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，(4±2)℃下避光保存。用1 mL的分度吸量管移取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯定容到10 mL，配制成10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，(4±2)℃下避光保存。

100 μg/mL甲基丁香酚內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液和10.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)中間液配制方法和保存條件同丁香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)中間液。

內(nèi)標(biāo)稀釋液：移取10.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)中間液1.00 mL，乙酸乙酯定容到10 mL，得到1.00 μg/mL的內(nèi)稀釋液；移取10.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)中間液0.40 mL，乙酸乙酯定容到10 mL，得到0.40 μg/mL的內(nèi)標(biāo)稀釋液，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用1 mL的分度吸量管和10 mL的容量瓶，移取適量10.0 μg/mL丁香酚標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙酸乙酯溶液逐級(jí)稀釋成濃度為0.005、0.01、0.05、0.10、0.15、0.50、1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液定容前，加入1.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)稀釋液1.00 mL，使得每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)物濃度均為0.10 μg/mL，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2樣品提取和凈化

水樣經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾，用50 mL量筒量取過濾后的水樣20.0 mL于三角瓶中，加入氯化鈉1.5～2.0 g，振蕩溶解。將水樣轉(zhuǎn)入100 mL分液漏斗中，加入20 mL正己烷，劇烈振蕩2 min后靜置5 min，收集上層有機(jī)相于100 mL三角瓶中。用15 mL正己烷重復(fù)提取一次，合并兩次萃取的有機(jī)相。加入4.0～5.0 g無水硫酸鈉，旋渦振蕩10 s后，轉(zhuǎn)入100 mL雞心瓶中。用5 mL正己烷洗滌無水硫酸鈉，合并正己烷于雞心瓶中。于37℃減壓濃縮至8～10 mL，用于固相萃取。

硅膠固相萃取柱(2 g/6 mL)預(yù)先用3 mL正己烷活化，上樣，4 mL正己烷淋洗，8 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于玻璃刻度試管中，40 ℃氮吹至1.5 mL，加入0.40 μg/mL內(nèi)標(biāo)樣液添加液0.5 mL，定容到2 mL，混勻，0.22 μm有機(jī)相針式過濾器過濾，供氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3儀器條件

1)色譜條件

色譜柱：Thermo TG-1701MS石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；色譜柱升溫程序：初始溫度為80℃，保持2 min；10℃/min升溫至185℃；20℃/min升溫至250℃，保持4 min。

2)質(zhì)譜條件

電離模式：電子轟擊電離源(EI)，能量：70 eV；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲10 min。

離子檢測(cè)方式：選擇離子檢測(cè)(SIM)，丁香酚檢測(cè)離子為：103、131、149、164，定量離子164；甲基丁香酚檢測(cè)離子：103、147、163、178，定量離子178。

1.3.4結(jié)果計(jì)算

采用內(nèi)標(biāo)法單離子定量，選定濃度與樣液相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中的丁香酚和甲基丁香酚響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性范圍內(nèi)，水體中丁香酚含量計(jì)算公式如下：

(1)

式中：X為試樣中目標(biāo)物質(zhì)的含量，μg/L；A為樣液中丁香酚的峰面積；Cs為標(biāo)準(zhǔn)工作液中丁香酚的濃度，μg/mL；Bs為標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；B為樣液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)工作液中丁香酚的峰面積；Vm為試樣體積，mL；V為試樣定容體積，mL。

2　結(jié)果與分析

2.1不確定度來源

從檢測(cè)過程和計(jì)算公式進(jìn)行分析，樣品測(cè)定不確定度來源主要包括以下幾個(gè)方面：標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度urel(std)、樣品稱量引入的不確定度urel(m)、樣液定容引入的不確定度urel(Vd)、儀器測(cè)定引入的不確定度urel(Y)、樣品提取凈化過程重復(fù)性引入的不確定度urel(rep)，如圖1所示。

2.2各分量不確定的計(jì)算

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度urel(std)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過程，標(biāo)準(zhǔn)工作引入的不確定度包含兩個(gè)分量：丁香酚標(biāo)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度urel(Ceugenol)和標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過程引入的不確定度urel(Vw)。

1)丁香酚標(biāo)儲(chǔ)備液引入的不確定度urel(Ceugenol)

(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度urel(P)

丁香酚純度為99%，最大允許誤差為1%，服從正態(tài)分布，95%置信水平包含因子k=2，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P)=0.01/2=5.00×10-3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(P)=5.00×10-3。

(2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度urel(Mr)

(3)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的不確定度urel(Vs)

2)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過程引入的不確定度urel(Vw)

(1)量器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vw1)

由于采用內(nèi)標(biāo)法定量，在評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度時(shí)，需同時(shí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)工作液中的目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)引入的不確定度。根據(jù)丁香酚含量結(jié)果計(jì)算的數(shù)學(xué)公式，結(jié)果僅與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值有關(guān)，而與內(nèi)標(biāo)實(shí)際濃度值無關(guān)。同時(shí)，由于標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液中的內(nèi)標(biāo)都來源于10.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)中間液，因此，內(nèi)標(biāo)對(duì)檢測(cè)結(jié)果不確定度的引入，與內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制和稀釋到10.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)中間液之前的過程無關(guān)。內(nèi)標(biāo)加入到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的環(huán)節(jié)，是在標(biāo)準(zhǔn)工作液最終定容到10 mL前，加入1.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)稀釋液1.00 mL。

urel(Vw1)=

=8.80×10-3

表1　標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋量器校準(zhǔn)引入的不確定度

注：稀釋過程使用的分度吸量管和容量品均為A級(jí)。

Note：The graduated pipettes and volumetric flasks used in dilution process of standard solution are grade A.

(2)環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vw2)

2.2.2樣品稱量引入的不確定度urel(m)

2.2.3樣液定容引入的確定度urel(Vd)

由于采用內(nèi)標(biāo)法定量，樣液定容不確定度來源于樣液中加入的內(nèi)標(biāo)量。樣液中內(nèi)標(biāo)引入是在樣液進(jìn)儀器分析前，加入0.50 mL濃度為0.40 μg/mL的內(nèi)標(biāo)稀釋液。

1)量器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vd1)

urel(Vd1)=

=0.010 5

表2　內(nèi)標(biāo)稀釋及加入樣液過程量器校準(zhǔn)引入的不確定度

注：稀釋過程使用的分度吸量管和容量品均為A級(jí)。

Note：The graduated pipettes andvolumetric flasks used in process of standard solution diluted are grade A.

2)環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vd2)

2.2.4儀器測(cè)定引入的不確定度urel(Y)

2.2.5樣品前處理重復(fù)性引入的不確定度urel(rep)

表3　加標(biāo)水樣平行檢測(cè)結(jié)果

2.3合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

上述各項(xiàng)不確定度分量見表4，互相獨(dú)立，養(yǎng)殖水體中丁香含量檢測(cè)合成相對(duì)不確定度為：urel(X)=

表4　不確定度分量表

根據(jù)不確定度評(píng)定指南[8]，在95%置信水平，推薦包含因子k=2。試樣中丁香酚含量測(cè)定的擴(kuò)展不確定度為：U(X)=k×u(X)=2×2.5=5.0 μg/L。因此，結(jié)果表述為：檢測(cè)結(jié)果平均值及其不確定度為(50.2±5.0)μg/L。

2.4不同濃度點(diǎn)的不確定度差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響

本方法采用的定量方式為內(nèi)標(biāo)法單離子定量，選定濃度與樣液相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積比計(jì)算。由于不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋次數(shù)不同，濃度越低的標(biāo)準(zhǔn)工作液，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度越高，對(duì)結(jié)果引入的不確定度也相應(yīng)增大。本方法標(biāo)準(zhǔn)工作液最高濃度點(diǎn)為1.00 μg/mL，最低濃度點(diǎn)為0.005 μg/mL，按照上述方法計(jì)算，對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為urel(std1.00)=0.013 4和urel(std0.005)=0.016 7，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為urel(X1.00)=0.049和urel(X0.005)=0.050。因此，由標(biāo)準(zhǔn)工作液不確定度不同，而導(dǎo)致最終檢測(cè)結(jié)果不確定度的差異可以忽略。

3　結(jié)論

本研究從標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品稱量、樣液定容、儀器測(cè)定、樣品前處理重復(fù)性等幾方面對(duì)養(yǎng)殖水體中丁香酚殘留檢測(cè)結(jié)果的不確定度進(jìn)行分析。由表4可知，檢測(cè)結(jié)果不確定度主要來源于樣品提取凈化過程重復(fù)性和儀器測(cè)定。因此，要保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠應(yīng)注意以下四方面：1)嚴(yán)格控制樣品前處理過程，特別強(qiáng)調(diào)操作的規(guī)范性；2)控制好氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀的工作環(huán)境條件及儀器中易污染部件的潔凈，降低由儀器測(cè)定引入的不確定度；3)標(biāo)準(zhǔn)工作液和陽性樣品的儀器測(cè)定值，必須以多次進(jìn)樣的算術(shù)平均值參與結(jié)果計(jì)算；4)陽性樣品要以平行樣品的算術(shù)平均值作為檢測(cè)結(jié)果，單樣的檢測(cè)結(jié)果不確定度大。

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Uncertainty evaluation for detecting eugenol in aquaculture water by gas chromatography mass spectrometric

LIU Haixin，YU Ying，TANG Shuifen，WANG Lijuan，LUO Fangfang

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

According to the procedure for uncertainty assessment，we evaluated the measurement uncertainty of detecting eugenol in aquaculture water by GC-MS method which established in our lab.The components of uncertainty in the detecting process were studied and analyzed，including standard work solution，weighting sample，constant sample solution volume，instrument detection and sample preparation repeatability，then calculating and combining these components of uncertainty.At the 95% confidence level，the coverage factor k=2，expanding the method uncertainty.The results showed the major factors of uncertainty in this method were sample preparation repeatability and instrument detection.In order to insure that the detecting results are accuracy and reliable，we should standardize the operation，strictly control environmental condition and increase parallel sample.

uncertainty；eugenol；aquaculture water；gas chromatography mass spectrometric

2016-05-22

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2016R1003-14)；閩臺(tái)重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟(jì)生物種質(zhì)庫與資源高效開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)(14PZY017NF17).

劉海新(1974-)，男，副研究員，主要從事水產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)研究.E-mail：liuhaixin303@163.com

O657

A

1006-5601(2016)04-0310-08

劉海新，余穎，湯水粉，等.氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量不確定度評(píng)定[J].漁業(yè)研究，2016，38(4)：310-317.