李　聰，袁莉剛，張　勇

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 )

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高原地區(qū)小尾寒羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白分布特征研究

李聰，袁莉剛*，張勇

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 )

旨在研究高原地區(qū)小尾寒羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的分布特征。應(yīng)用Masson’s、Gomori’s、PAS和 AB-PAS(pH=2.5)組織化學(xué)染色方法觀察5只健康成年高原地區(qū)小尾寒羊附睪的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而用免疫組織化學(xué)SP法觀察層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原蛋白(Col Ⅳ)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的分布特征。高原地區(qū)小尾寒羊附睪各部分管腔為柱狀纖毛上皮，附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維較附睪頭及附睪體明顯增多。PAS反應(yīng)顯示附睪頭和附睪尾陽性強(qiáng)于附睪體，AB-PAS反應(yīng)顯示附睪頭、體、尾陽性差異較小。免疫組織化學(xué)顯示，Col Ⅳ在附睪頭和附睪體組織中表達(dá)最強(qiáng)，HSPG次之，LN表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽性表達(dá)差異不顯著(P>0.05)；而HSPG在附睪尾組織中表達(dá)最強(qiáng)，LN次之，Col Ⅳ表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽性表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。高原地區(qū)小尾寒羊附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分中PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，附睪頭和附睪尾輸精管的分泌功能增強(qiáng)。附睪頭上皮基細(xì)胞Col Ⅳ、HSPG和LN分泌增加，且Col Ⅳ、HSPG和LN與血管的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。

高原地區(qū)小尾寒羊；附睪；Ⅳ型膠原蛋白；層粘連蛋白；硫酸乙酰肝素蛋白多糖；組織化學(xué)

小尾寒羊四季發(fā)情，全年可配種，具有極高的繁殖力，是中國獨(dú)特的遺傳資源[1]。哺乳動(dòng)物附睪具有儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟精子的作用[2]，分布于附睪管固有層、上皮和間質(zhì)區(qū)的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)主要包括膠原蛋白I、III、Ⅳ (Type Ⅳ Collage，Col Ⅳ)、層粘連蛋白(Laminin，LN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)等，能夠維持組織和細(xì)胞的形態(tài)和功能，并在生長、分化過程中起重要作用[3]。

哺乳動(dòng)物睪丸生精小管基膜富含Col Ⅳ、LN、HSPG、制動(dòng)素以及纖維粘蛋白等[4]。Col Ⅳ是由α肽鏈組成的異源三聚體螺旋結(jié)構(gòu)的非原纖維膠原蛋白，形成器官基膜的力學(xué)結(jié)構(gòu)[5]；HSPG則是由5個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)域組成的蛋白多糖，維持基膜的穩(wěn)定性并與基膜的濾過作用有關(guān)[6]；而由α、β、γ 3種肽鏈組成的異源三聚體糖蛋白LN是基膜中最豐富的一種ECM[7]。成年小鼠附睪各部分管壁基膜有Ⅳ型膠原和LN的分布[8]。附睪ECM成份在其生長繁殖過程中有重要調(diào)控的作用。筆者的前期研究表明，高原型成年藏綿羊附睪各部分中PAS(Periodic acid-schiff stain，PAS)的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，Col Ⅳ參與基膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；HSPG與血-附睪屏障構(gòu)成相關(guān)；LN與基膜的形成及其他ECM的合成和分泌有關(guān)[9]。高原地區(qū)小尾寒羊?qū)η嗖馗咴沫h(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，能在氣候寒冷、牧草生長期短、空氣稀薄的惡劣環(huán)境下生活并繁育后代，附睪細(xì)胞外基質(zhì)在高原地區(qū)小尾寒羊的生殖繁育過程中起到重要的調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，本研究采用組織化學(xué)方法對高原地區(qū)小尾寒羊附睪組織中ECM相關(guān)纖維(膠原纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖(糖原、酸性粘多糖及中性粘多糖)以及蛋白(LN、Col Ⅳ和HSPG)等成份的分布特征進(jìn)行比較觀察，分析高原低氧環(huán)境對小尾寒羊的精子成熟環(huán)境的影響，為進(jìn)一步研究高寒地區(qū)小尾寒羊生殖發(fā)育特點(diǎn)提供參考資料。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

健康2歲成年小尾寒羊附睪樣品采自青海牧民養(yǎng)殖場，共5對，通過睪丸摘除手術(shù)采集。以4%中性福爾馬林溶液固定3 d后備用。

1.2主要試劑

Ⅳ型膠原兔抗鼠多克隆抗體(bs-4595R)、LN兔抗鼠多克隆抗體(bs-8561R)和HSPG兔抗鼠多克隆抗體(bs-5072R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)和(ZLI-9502)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3普通切片制備

新鮮組織樣品稱重測量，記錄解剖數(shù)據(jù)，4%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚 5 μm)，相鄰切片分為8套，其中3套分別用于Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、LN和HSPG免疫組織化學(xué)SP法染色，剩5套用于組織化學(xué)Masson’s、Gomori’s、PAS、AB-PAS (Alcian blue-periodic acid schiff，pH=2.5)染色及陰性對照。

1.4組織化學(xué)染色法

切片脫水、脫蠟后分別進(jìn)行Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS染色，之后繼續(xù)進(jìn)行脫水、透明，然后封片、觀察、拍照。Masson’s三色(亮綠)染色，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)綠色，細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，紅細(xì)胞呈紅色；Gomori’s銀染顯示網(wǎng)狀纖維為灰色，蘇木素-伊紅復(fù)染后呈棕紅色;PAS染色顯示糖原及其他PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)均呈陽性，細(xì)胞核呈藍(lán)色；AB-PAS(pH=2.5)染色顯示酸性黏液物質(zhì)呈藍(lán)色，中性黏液物質(zhì)呈紅色，混合呈紫紅色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。

1.5免疫組織化學(xué)SP法檢測Col Ⅳ、LN和HSPG的分布

免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色；切片脫水、脫蠟后，進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，后加一抗，一抗用Col Ⅳ、LN和HSPG多克隆抗體，Col Ⅳ按1∶400比例稀釋，LN和HSPG均按1∶600比例稀釋，陰性對照組用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗(Col Ⅳ、LN和HSPG)，4 ℃過夜，孵育、清洗、顯色、脫水、透明、封片。然后顯微鏡進(jìn)行觀察、照相。

1.6圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片隨機(jī)選取5張，每組切片中在400倍顯微鏡(Olympus)下進(jìn)行拍照，每張切片照片采集5個(gè)視野，用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測定陽性反應(yīng)物的平均光密度，并用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)　果

2.1高原地區(qū)小尾寒羊附睪纖維及糖成份的組織化學(xué)特征

光鏡下，高原地區(qū)小尾寒羊附睪各管腔上皮可見4～5層上皮細(xì)胞，管周肌樣細(xì)胞胞核呈長梭形圍繞各附睪管固有膜外周，大量成熟精子分布于腔面(圖1F)；間質(zhì)結(jié)締組織較發(fā)達(dá)，富含膠原纖維(圖1A～C)、網(wǎng)狀纖維和血管(圖1D～F)，且附睪頭和附睪體間質(zhì)膠原纖維(圖1A，B)和網(wǎng)狀纖維(圖1D，E)較少，附睪尾間質(zhì)膠原纖維(圖1C)和網(wǎng)狀纖維(圖1F)明顯增多；附睪頭和附睪體管腔內(nèi)纖毛較長(圖1D，B)，而附睪尾管腔內(nèi)纖毛較短，變?yōu)樗罹壗Y(jié)構(gòu)清晰(圖1F)。PAS染色顯示各附睪管上皮固有膜、間質(zhì)毛細(xì)血管壁、基細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞及腔面精子紫紅色糖原陽性條帶明顯(圖1G～I(xiàn))，附睪頭上皮游離緣和附睪尾刷狀緣呈強(qiáng)陽性(圖1G，I)，且附睪頭和附睪尾PAS陽性反應(yīng)強(qiáng)于附睪體(圖1G～I(xiàn))。AB-PAS染色顯示各部分細(xì)胞核為藍(lán)色，附睪各部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、柱狀上皮下固有膜、基細(xì)胞及管周肌樣細(xì)胞呈深紫紅色(圖1J～L)，附睪頭和附睪尾上皮游離緣和腔面精子呈深紫紅色(圖1J，L)，但附睪頭、體、尾AB-PAS陽性強(qiáng)弱差異較小(圖1J～L)。

2.2高原地區(qū)小尾寒羊附睪組織中Col Ⅳ、LN和HSPG的分布

高原地區(qū)小尾寒羊附睪細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)染色顯示，Col Ⅳ在附睪頭上皮基細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腔面精子呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其他上皮細(xì)胞和纖毛呈中等陽性表達(dá)，管周肌樣細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)(圖2A)；在附睪體和附睪尾管腔上皮細(xì)胞、纖毛和腔面精子呈強(qiáng)陽性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)(圖2B，C)，但附睪頭陽性表達(dá)率高于附睪體，附睪體陽性表達(dá)率高于附睪尾(表1)。HSPG在附睪頭上皮基細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其他上皮細(xì)胞和纖毛呈中等陽性表達(dá)，管周肌樣細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)(圖2D)；在附睪體和附睪尾管腔上皮細(xì)胞和纖毛呈強(qiáng)陽性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子呈弱陽性表達(dá)(圖2E，F(xiàn))，但附睪頭的陽性表達(dá)率高于附睪體和附睪尾，附睪體和附睪尾的陽性表達(dá)率差異較小(表1)。LN在附睪頭上皮基細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腔面精子呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其他上皮細(xì)胞、纖毛和管周肌樣細(xì)胞成中等陽性表達(dá)(圖2G)；在附睪體和附睪尾管腔上皮細(xì)胞、纖毛和血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，腔面精子和管周肌樣細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)(圖2H，I)，但附睪頭的陽性表達(dá)率高于附睪體和附睪尾，附睪體和附睪尾的陽性表達(dá)率差異較小(表1)。各蛋白陰性對照無表達(dá)(圖2J～L)。

表1高原地區(qū)小尾寒羊附睪Col Ⅳ、LN和HSPG的平均光密度

Table 1The average optical density of Col Ⅳ、LN and HSPG in epididymitis of Small-tail Han sheep in plateau

分類ClassificationColⅣ平均光密度TheaverageopticaldensityofColⅣHSPG平均光密度TheaverageopticaldensityofHSPGLN平均光密度TheaverageopticaldensityofLN附睪頭Caput0.0449±0.0027*0.0392±0.0036a0.0378±0.0033a附睪體Corpus0.0401±0.0022*0.0328±0.0043a0.0322±0.0051a附睪尾Cauda0.0282±0.0025a0.0345±0.0037*0.0337±0.0048*

同行標(biāo)有*表示差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有相同字母的無明顯差異(P>0.05)

In the column， *means significant difference between groups(P<0.05)，same letters means no significant difference between groups(P>0.05)

BC.基細(xì)胞；CA.纖毛；CF.膠原纖維；ED.附睪管；G.糖原；MC.主細(xì)胞；PC.管周肌樣細(xì)胞；RF.網(wǎng)狀纖維；SD.輸精管；SZ.精子；TED.睪丸輸出管；V.血管。A、D、G、J.成年高原地區(qū)小尾寒羊睪丸輸出管；B、E、H、K.成年高原地區(qū)小尾寒羊附睪管；C、F、I、L.成年高原地區(qū)小尾寒羊輸精管BC.Basal cells; CA.Cilia; CF. Collagen fiber; ED.Epididymal duct; G.Glycogen; MC.Main cells; PC.Peritubular myoid cells; RF.Reticular fiber; SD.Seminiferous duct; SZ.Spermatozoon; TED.Testicular efferent duct; V.Vessel.A,D,G,J.The structure of testicular efferent duct in Small-tail Han sheep in plateau. Masson’s staining. B,E,H,K.The structure of epididymal duct in Small-tail Han sheep in plateau. Masson’s staining. C,F,I,L.The structure of seminiferous duct in Small-tail Han sheep in plateau. Masson’s staining. 圖1　高原地區(qū)小尾寒羊附睪Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS組織化學(xué)染色(bar=20 μm)Fig.1　The histochemistry of Masson’s,Gomori’s,PAS and AB-PAS staining in epididymis of Small-tail Han sheep in plateau (bar=20 μm)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，LN、HSPG和Col Ⅳ在附睪體和附睪尾的表達(dá)規(guī)律相一致。Col Ⅳ在附睪頭和附睪體組織中表達(dá)最強(qiáng)，HSPG次之，LN表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽性表達(dá)差異不顯著(表1，P>0.05)；而HSPG在附睪尾組織中表達(dá)最強(qiáng)，LN次之，Col Ⅳ表達(dá)較弱，HSPG和LN的陽性表達(dá)差異不顯著(表1，P>0.05)。

BC.基細(xì)胞；CA.纖毛；ED.附睪管；MC.主細(xì)胞；PC.管周肌樣細(xì)胞；SD.輸精管；SZ.精子；TED.睪丸輸出管；V.血管。A、D、G.Col IV、HSPG和LN在成年高原地區(qū)小尾寒羊睪丸輸出管中的表達(dá)；B、E、H.Col IV、HSPG和LN在成年高原地區(qū)小尾寒羊附睪管中的表達(dá)；C、F、I.Col IV在成年高原地區(qū)小尾寒羊輸精管中的表達(dá)；J、K、L.陰性對照BC.Basal cells; CA.Cilia; ED.Epididymal duct; MC.Main cells; PC.Peritubular myoid cells; SD.Seminiferous duct; SZ.Spermatozoon; TED.Testicular efferent duct; V.Vessel.A,D,G.The expresstion of Col IV,HSPG and LN in testicular efferent duct of Small-tail Han sheep in plateau;B,E,H.The expresstion of Col IV,HSPG and LN in epididymal duct of Small-tail Han sheep in plateau; C,F,I.The expresstion of Col IV,HSPG and LN in seminiferous duct of Small-tail Han sheep in plateau. J,K,L.Negative control圖2　高原地區(qū)小尾寒羊附睪的免疫組織化學(xué)染色 (bar=20 μm)Fig.2　The immunohistochemical staining in epididymidis of Small-tail Han sheep in plateau (bar=20 μm)

Col Ⅳ表達(dá)的平均光密度值在高原地區(qū)成年小尾寒羊附睪頭和附睪體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(與HSPG和LN組相比，P<0.05)；HSPG和LN表達(dá)的平均光密度值在高原地區(qū)成年小尾寒羊附睪尾具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(與Col Ⅳ組相比，P<0.05)The average optical density of Col Ⅳ expression was significantly higher in caput and corpus of Small-tail Han sheep in plateau(compared with counterparts of HSPG and LN)；The average optical density of LN and HSPG expression was significantly higher in cauda of Small-tail Han sheep in plateau(compared with counterparts of Col Ⅳ)圖3　Col Ⅳ、LN和HSPG在高原地區(qū)成年小尾寒羊附睪表達(dá)平均光密度檢測柱形圖Fig.3　Column graph of average optical density of Col Ⅳ，LN and HSPG in epididymitis of Small-tail Han sheep in plateau

3　討　論

附睪ECM各成份以纖維、蛋白多糖及基質(zhì)等各種形式參與附睪管的構(gòu)建。多數(shù)器官中Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原纖維并存，以Ⅰ型膠原纖維為主[10]。小鼠附睪管外圍為Ⅰ型膠原纖維，其含量從附睪頭至附睪尾逐漸增加[11]。D.R.Keene等[12]發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原纖維有較強(qiáng)的伸展性。本研究中小尾寒羊附睪各管腔外圍膠原纖維豐富，但附睪尾膠原纖維的分布較附睪頭和附睪體明顯增多，可能與Ⅰ型膠原纖維良好的伸展性促進(jìn)附睪尾的收縮功能運(yùn)送精子到輸精管有關(guān)。網(wǎng)狀纖維位于疏松結(jié)締組織，由Ⅲ型膠原蛋白形成，并常伴其他類型的膠原、蛋白多糖和糖蛋白[13]。隨著年齡的增長，網(wǎng)狀纖維可以轉(zhuǎn)化為膠原纖維[14]，F(xiàn).A.Fakoya等[15]發(fā)現(xiàn)大鼠睪丸間質(zhì)中的網(wǎng)狀纖維可以為精子形成過程中精子從生精小管上皮到腔面的遷移提供結(jié)構(gòu)支持。本研究中小尾寒羊附睪各管腔外圍網(wǎng)狀纖維較豐富，但附睪尾網(wǎng)狀纖維的分布較附睪頭和附睪體明顯增多，提示網(wǎng)狀纖維的分布規(guī)律與膠原纖維一致，附睪間質(zhì)網(wǎng)狀纖維可能也為精子的成熟提供結(jié)構(gòu)支持，附睪尾間質(zhì)網(wǎng)狀纖維較多可能與其較強(qiáng)的收縮能力促進(jìn)精子運(yùn)輸有關(guān)。

附睪為精子的貯存和成熟提供了適宜的微環(huán)境，具有分泌、吸收、收縮和濃縮等功能。P.M.Wassarman等[16]認(rèn)為精子與卵子的特異性識(shí)別是依賴于精子表面的糖蛋白和透明帶糖蛋白互補(bǔ)而實(shí)現(xiàn)的，精子表面的中性和酸性粘多糖參與細(xì)胞之間的識(shí)別及信息交流。本研究中小尾寒羊各附睪管PAS和AB-PAS染色腔面精子可見較強(qiáng)陽性反應(yīng)帶，提示精子表面的中性和酸性粘多糖在附睪管中已經(jīng)具備，為進(jìn)一步精子與卵子的特異性識(shí)別奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。B.C.Moore等[17]發(fā)現(xiàn)美國短吻鱷睪丸組織PAS和AB-PAS反應(yīng)顯示基膜和管周肌樣細(xì)胞呈陽性。本研究中小尾寒羊各附睪管PAS和AB-PAS反應(yīng)顯示基膜和管周肌樣細(xì)胞均有紫紅色陽性反應(yīng)條帶，提示基膜和管周肌樣細(xì)胞與中性和酸性粘多糖的合成有關(guān)。R.E.Glegg等[18]發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀纖維較豐富的區(qū)域，其PAS反應(yīng)也較強(qiáng)；與本研究結(jié)果一致，小尾寒羊附睪尾間質(zhì)網(wǎng)狀纖維分布較多，PAS反應(yīng)也較強(qiáng)。亮細(xì)胞主要存在于大鼠附睪的尾部，是PAS陽性細(xì)胞分泌周期中的一種狀態(tài)[19]；大白鼠附睪頭、體、尾PAS反應(yīng)陽性逐漸增強(qiáng)是因?yàn)榱良?xì)胞的數(shù)量逐漸增多導(dǎo)致[20]。本研究中PAS染色顯示各附睪管上皮固有膜、間質(zhì)毛細(xì)血管壁、基細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞及腔面精子紫紅色糖原陽性條帶明顯，附睪頭上皮游離緣和附睪尾刷狀緣呈強(qiáng)陽性，且附睪頭和附睪尾PAS陽性反應(yīng)強(qiáng)于附睪體，提示PAS反應(yīng)的強(qiáng)弱和亮細(xì)胞的數(shù)量有直接關(guān)系，附睪尾PAS反應(yīng)較強(qiáng)與亮細(xì)胞數(shù)量較多及網(wǎng)狀纖維含量較多有關(guān)。附睪上皮PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，附睪尾分泌功能較強(qiáng)，而附睪頭PAS反應(yīng)較強(qiáng)，提示附睪頭亮細(xì)胞數(shù)目較多，分泌功能增強(qiáng)。AB-PAS陽性反應(yīng)的糖原、糖蛋白和蛋白多糖典型存在于結(jié)締組織黏液以及基膜中[17]。本研究中AB-PAS染色顯示各部分細(xì)胞核為藍(lán)色，附睪各部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、柱狀上皮下固有膜、基細(xì)胞及管周肌樣細(xì)胞呈深紫紅色，附睪頭和附睪尾上皮游離緣和腔面精子呈深紫紅色，但附睪頭、體、尾陽性反應(yīng)強(qiáng)弱差異較小，提示各附睪管上皮下固有膜和間質(zhì)區(qū)域富含酸性粘多糖。本研究中小尾寒羊附睪頭、體、尾AB-PAS陽性反應(yīng)強(qiáng)弱差異較小，而附睪頭和附睪尾PAS陽性反應(yīng)強(qiáng)于附睪體，提示附睪頭、體、尾各管腔酸性粘多糖的含量差異較小，附睪頭和附睪尾管腔中性粘多糖含量較附睪體多，而附睪頭和附睪尾的分泌能力強(qiáng)于附睪體，附睪上皮的分泌能力對中性及酸性粘多糖含量的影響有待于進(jìn)一步的探究。

Col Ⅳ是基膜的主要膠原成分，形成結(jié)構(gòu)網(wǎng)架，廣泛存在于各種基膜中，使其具有韌性和通透性，對基質(zhì)和細(xì)胞間物質(zhì)交換具有篩板作用[21]。Col Ⅳ主要在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞合成，是上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞等生長的依附和支架，不僅有促進(jìn)血管生成的作用，還可以抑制血管生成[22]。本研究中Col Ⅳ在小尾寒羊附睪頭上皮基細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)；在附睪體和附睪尾管腔基膜呈強(qiáng)陽性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，提示Col Ⅳ對基膜及基膜上基細(xì)胞有一定的調(diào)節(jié)作用，與血管的生成也有密切的關(guān)系。在哺乳動(dòng)物的附睪中，各附睪管基膜是ECM的特殊型，可以作為細(xì)胞遷移的附著物和選擇性濾過屏障[23]，而膠原是良好的細(xì)胞粘附基質(zhì)，在組織中含量豐富[24]。本研究中Col Ⅳ在小尾寒羊各附睪管基膜均為強(qiáng)陽性表達(dá)，提示Col Ⅳ參與基膜和細(xì)胞間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明牦牛犢牛睪丸管周肌樣細(xì)胞與Ⅳ型膠原的合成和分泌有關(guān)[25]。本研究中小尾寒羊各附睪管管周肌樣細(xì)胞均為弱陽性表達(dá)，提示附睪各段管周肌樣細(xì)胞分泌Col Ⅳ的能力較弱。

HSPG是基膜中普遍存在的重要成分，具有細(xì)胞黏附、聚集及構(gòu)建組織的作用，能結(jié)合基膜的LN和Col Ⅳ等多種成分，并與ECM的多樣性密切相關(guān)[26]。免疫組化研究證實(shí)，HSPG在成熟且高度分化的上皮細(xì)胞不表達(dá)[27]。本研究中HSPG在小尾寒羊附睪頭上皮基細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其他上皮細(xì)胞呈中等陽性表達(dá)；而在附睪體和附睪尾管腔上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表明HSPG在附睪頭除基細(xì)胞外的其他上皮細(xì)胞表達(dá)較弱可能與附睪頭除基細(xì)胞外其他上皮細(xì)胞的分化程度有關(guān)。HSPG可作為血管生長因子的儲(chǔ)存庫[28]。HSPG大量表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，在血管形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞表面HSPG可作為某些血管生長因子和抑制因子的輔助受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[29]。本研究中HSPG在小尾寒羊附睪頭間質(zhì)血管呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在附睪體和附睪尾間質(zhì)血管呈弱陽性表達(dá)，提示HSPG在血管發(fā)育過程中有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究中小尾寒羊各附睪管管周肌樣細(xì)胞均為弱陽性表達(dá)，提示小尾寒羊附睪各段管周肌樣細(xì)胞分泌HSPG的能力較弱。

LN屬于糖蛋白，為基膜的主要成分之一，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、分化及細(xì)胞移動(dòng)等作用[24]。研究表明LN由位于基膜上的上皮細(xì)胞合成[30]，本研究中LN在小尾寒羊各附睪管基膜均為強(qiáng)陽性表達(dá)，提示LN和基膜的形成密切相關(guān)。睪丸生精小管基膜的基本成分如LN是PAS特殊反應(yīng)陽性糖蛋白[17]，因此，本研究中各附睪管基膜基本成分LN可能與PAS合成及分泌相關(guān)。LN由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌[31]。本研究中小尾寒羊各附睪間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞均為強(qiáng)陽性表達(dá)，LN對血管生長有重要作用。牦牛犢牛睪丸管周肌樣細(xì)胞可能與LN的合成和分泌有關(guān)[25]。本研究中小尾寒羊附睪頭管周肌樣細(xì)胞呈中等陽性表達(dá)，而附睪體和附睪尾各管周肌樣細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，提示附睪頭管周肌樣細(xì)胞分泌LN的能力強(qiáng)于附睪體和附睪尾。HSPG可以和Ⅳ型膠原和LN構(gòu)成基膜[32]，LN通過巢蛋白與Ⅳ型膠原形成穩(wěn)定的基膜[33]。本研究中小尾寒羊各附睪管管腔LN與HSPG和Col Ⅳ的表達(dá)規(guī)律基本一致，提示LN的形成與HSPG和Col Ⅳ有關(guān)。

4　結(jié)　論

高原地區(qū)小尾寒羊附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分中PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān)，附睪頭和附睪尾輸精管的分泌功能增強(qiáng)。附睪頭上皮基細(xì)胞Col Ⅳ、HSPG和LN分泌增加，且Col Ⅳ、HSPG和LN與血管的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。

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(編輯程金華)

The Distribution of Extracellular Matrix Proteins in Small-tail Han Sheep Epididymis in Plateau

LI Cong，YUAN Li-gang*，ZHANG Yong

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

To explore the distribution of extracellular matrix proteins in epididymis of Small-tail Han sheep in plateau.The histochemistry of Masson’s，Gomori’s，PAS and AB-PAS(pH=2.5)staining were used to study the microstructure of epididymis in 5 pairs of Small-tail Han sheep in plateau，and the distribution of the laminin (LN)，type Ⅳ collagen (Col Ⅳ) and heparan sulfate glycoprotein (HSPG) were identified by SP immunohistochemical method.The observations made with the light microscope showed that the epithelium of epididymal ducts were columnar ciliated and the distribution of the collagen and reticular fibers in the cauda were more abundant than the caput and the corpus，although the PAS positive reaction in the caput and the cauda were stronger than the corpus，but the AB-PAS positive reaction without significant differences in the caput，the corpus and the cauda.Immunohistochemical analysis appeared that Col Ⅳ was strongly presented in the caput and the corpus，the relative expression of HSPG was lower than Col Ⅳ，and LN was expressed weakly，the distribution of LN and HSPG without statistical differences in epididymis (P>0.05)，but in the cauda，it was showed that HSPG was strongly presented，the Col Ⅳ was lower than LN and HSPG，and the distribution of LN and HSPG without statistical differences in epididymis (P>0.05).Taken together，the collagen and reticular fibers of the epididymis cauda were more abundant than the caput and corpus in Small-tail Han sheep from plateau，and the positive of the PAS reaction was companied with the changes of the secretion function of epithelium.The secretion of Col Ⅳ，HSPG and LN in the basal cells of caput epithelium were increased than the other parts，and the Col Ⅳ，HSPG and LN might work together closely for the regulation of the vessel.

Small-tail Han sheep in plateau；epididymis；type Ⅳ collagen；laminin；heparan sulfate proteoglycan；histochemistry

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.006

2016-03-02

甘肅省財(cái)政廳基本科研業(yè)務(wù)項(xiàng)目(2012)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160488)；甘肅省自然科學(xué)研究基金(145RJZA223)

李聰(1991-)，女，青海大通人，碩士，主要從事動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究,E-mail:393803599@qq.com

袁莉剛, 教授，E-mail：yuanyuanxi2011@hotmail.com

S852.16+2

A

0366-6964(2016)08-1565-09