趙　晶　張福仁　王建文　陳聲利　周桂芝　劉永霞　陳學(xué)超　盧憲梅

TOX與Notch1在MF中的表達(dá)

趙晶1，2張福仁2王建文2陳聲利2周桂芝2劉永霞2陳學(xué)超2盧憲梅2

目的： 檢測TOX蛋白及活化型Notch1蛋白在MF中的表達(dá)，探討TOX及Notch1蛋白作為MF分子標(biāo)記物的可行性。方法： 采用免疫組化方法檢測35例MF（15例斑片期，10例斑塊期，10例腫瘤期）和45例對照組（15例淋巴瘤樣丘疹病、15例扁平苔蘚、15例銀屑?。┑牟±斫M織標(biāo)本中TOX蛋白及活化型Notch1蛋白的表達(dá)。結(jié)果： TOX蛋白染色結(jié)果:MF陽性率約94.3%，且陰性標(biāo)本全部為斑片期，對照組陽性率75.6%。MF組TOX蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MF組與對照組所有病例腫瘤細(xì)胞Notch1陰性。結(jié)論： MF組與對照組TOX蛋白表達(dá)水平有顯著性差異，但還不足以證明TOX可作為診斷MF的分子標(biāo)記物，需進(jìn)一步驗(yàn)證。Notch1蛋白不在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，故無法作為MF的分子標(biāo)記物。

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤； 蕈樣肉芽腫； TOX； Notch信號通路； Notch1

蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）是原發(fā)性皮膚淋巴瘤中最常見的類型。早期 MF（early mycosis fungoides，eMF）的診斷至今仍是皮膚科的一個(gè)難題，其臨床及病理表現(xiàn)常常類似于良性炎癥性皮膚病，而且缺乏特異的分子標(biāo)記物。

2012年首次提出TOX（thymocyte selection-associated high mobility group box）基因，即胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率族基因，可以作為 MF的分子標(biāo)記物［1］。TOX在 MF進(jìn)程中所起的作用也有相關(guān)研究［2，3］。此后又有一些學(xué)者對TOX在MF中的表達(dá)進(jìn)行了不同的試驗(yàn)及驗(yàn)證，但是樣本量及對照樣本種類都有所限制，故本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)組與對照組的樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證研究，以期發(fā)現(xiàn)TOX在MF各階段以及其它皮膚疾病中的表達(dá)是否有顯著性差異。國內(nèi)劉潔團(tuán)隊(duì)采用免疫組化、RNA提取及RT-PCR、Western blot、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染、細(xì)胞遷移及入侵檢測等技術(shù)，最終提出TOX在MF皮損中高表達(dá)，且與MF的增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)，TOX是MF的一個(gè)診斷標(biāo)記，并在疾病進(jìn)展過程中具有病因?qū)W作用［2］。

Notch信號通路無第二信使，是一種構(gòu)造比較簡單的通路，迄今為止，已經(jīng)有不少學(xué)者證實(shí)Notch通路與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系，至今發(fā)現(xiàn)的Notch受體有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，而其中在腫瘤組織中Notch1受體通路異常報(bào)道最多。有研究表明，Notch1在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而且已有學(xué)者證實(shí)Notch1在T細(xì)胞淋巴瘤中的異常表達(dá)，但是至今沒有在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中的相關(guān)研究［4，5］，故本研究主要針對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中最常見的MF，進(jìn)行Notch1蛋白表達(dá)的檢測，分析活化型Notch1（NICD）在MF中的表達(dá)是否有特異性。

1　資料與方法

1.1研究對象 MF組及對照組均來自我院2011-2015年的病例，共80例，其中MF組患者35例（斑片期15例，斑塊期10例，腫瘤期10例），對照組包括淋巴瘤樣丘疹病15例、扁平苔癬15例、尋常型銀屑病15例。所有病理標(biāo)本蠟塊均來自于我院病理科。

1.2主要儀器及試劑 主要儀器包括:徠卡公司切片機(jī)RM2235、全自動(dòng)染色機(jī)ST5020、全自動(dòng)免疫組化機(jī)BOND-MAX、封片機(jī)CV5030，湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械公司攤片烤片機(jī)TKD-TK。一抗:兔抗人多克隆TOX抗體，購自SIGAM公司；兔抗人多克隆Notch1抗體，Notch胞內(nèi)段（NICD），購自MILLIPORE公司。二抗:二抗試劑盒，購自徠卡公司自動(dòng)免疫組化機(jī)配套試劑盒。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1預(yù)實(shí)驗(yàn) 分別將TOX抗體及活化型Notch1抗體稀釋不同濃度（1∶500，1∶300，1∶200，1∶100，1∶50），觀察染色效果，找到最適稀釋濃度。最終確定TOX及Notch1最適稀釋度均為1∶100。

1.3.2免疫組化檢測TOX及Notch1在實(shí)驗(yàn)組及對照組的表達(dá) 組織蠟塊切片機(jī)切片，攤片，并置于75℃烤片機(jī)上烤30 min。將切片置于全自動(dòng)染色機(jī)中脫蠟，順序依次為:二甲苯A 5 min，二甲苯B 5 min，無水乙醇A 5 min，無水乙醇B 5 min，95%乙醇1 min，85%乙醇1 min，75%乙醇1 min，自來水2 min。

在全自動(dòng)免疫組化機(jī)系統(tǒng)中添加病例，每個(gè)編號添加TOX及Notch1兩個(gè)玻片，并打印粘貼標(biāo)簽。將玻片依次放在卡槽上，按標(biāo)識將干凈的蓋板放置在玻片上，所有玻片放置完畢后，將玻片架保持水平輕輕推入儀器中，點(diǎn)擊裝載/卸載按鈕。

將TOX/Notch1抗體與稀釋液按1∶100稀釋度注入試劑瓶掃描條碼并錄入抗體信息。將一抗及二抗試劑盒置于試劑架上，系統(tǒng)自行檢查玻片、試劑、儀器均正常后，點(diǎn)擊運(yùn)行按鈕。機(jī)器開始運(yùn)行。染色結(jié)束后，取下玻片架及蓋板，并清洗蓋板。將染色完成的玻片置于全自動(dòng)染色機(jī)中脫水。脫水完成后切片放入自動(dòng)封片機(jī)封片。

1.4病理科醫(yī)師閱片、評分 每個(gè)切片由兩名皮膚病理專業(yè)醫(yī)師閱片，評分由陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)以及染色強(qiáng)度共同決定。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):40×10視野隨機(jī)觀察10個(gè)視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陰性為0分，1～25%為1分，26～50%為2分，51～75%為3分，76～100%為4分。

染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn):不著色為0分，淺棕黃為1分，金黃/棕黃為2分，棕褐色為3分。

蛋白表達(dá)水平由計(jì)數(shù)×染色強(qiáng)度，0分為-，1～3分為+，4～6分為++，7～9分為+++，10～12分為++++。

2　結(jié)果

免疫組化結(jié)果（MF均顯示分期，LyP:淋巴瘤樣丘疹病，LP:扁平苔蘚，診斷均經(jīng)過2位病理科醫(yī)師確診）結(jié)果均按照蛋白表達(dá)水平顯示（蛋白表達(dá)水平=計(jì)數(shù)×染色強(qiáng)度）。

2.1TOX蛋白染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組:35例MF中有33例TOX陽性，2例陰性，且2例陰性全部為斑片期；15例斑片期MF中2例陰性，10例+，3例++；10例斑塊期中6例+，2例++，2例+++；10例腫瘤期中4例+，4例++，2例++++（圖1，圖2）。對照組:15例淋巴瘤樣丘疹病中6例陰性，8例+，1例++；15例銀屑病中5例陰性，8例+，2例++；15例扁平苔癬13例+，2例++（圖3）。

2.2活化型Notch1蛋白染色結(jié)果 所有病例中僅有4例表達(dá)陽性（+），且均表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞陽性，并非是腫瘤細(xì)胞。4例分別為1例MF腫瘤期，2例淋巴瘤樣丘疹病，1例銀屑?。▓D4）。

對TOX蛋白表達(dá)強(qiáng)度采用Fisher’s exct test，MF組與對照組比較（MF組陰性表達(dá)2例，陽性33例；對照組陰性表達(dá)11例，陽性34例），P=0.0074（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和處理）。

圖1　腫瘤期MF標(biāo)本中TOX蛋白的表達(dá)

圖2　斑片期MF標(biāo)本中TOX蛋白的表達(dá)

圖3　對照組中TOX蛋白的表達(dá)

圖4　4a活化型Notch1蛋白在汗腺表達(dá)陽性（×200）；4b活化型Notch1蛋白在中性粒細(xì)胞表達(dá)陽性（×200）；4c活化型Notch1蛋白在MF腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)（×200）

3　討論

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）是一種表現(xiàn)在皮膚的一種特殊類型的T細(xì)胞淋巴瘤，早期的CTCL在臨床與組織病理表現(xiàn)上與良性炎癥性皮膚病很難區(qū)分，早期診斷比較困難［7］，這其中又以eMF為研究熱點(diǎn)。

eMF（斑片期及早期斑塊期）診斷困難主要是因?yàn)槿狈μ禺愋约?xì)胞及分子標(biāo)記物。Zhang等采用高通量基因組轉(zhuǎn)錄分析篩選出349個(gè)基因，在eMF與正常皮膚中存在差異性表達(dá)，后又在其中發(fā)現(xiàn)只有19個(gè)基因是在eMF中特異表達(dá)，在炎癥性皮膚病中無特異性［1］。其中TOX和PDCD1，在RNA表達(dá)上與炎癥性皮膚病比較有明顯不同，而且對eMF皮損行免疫組化及免疫熒光染色MF細(xì)胞以及Pautrier’s微膿腫中均有TOX特異性染色表現(xiàn)，于是進(jìn)而提出TOX可作為MF分子標(biāo)記物［1］。2014年其團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步對113例MF標(biāo)本進(jìn)行了TOX表達(dá)水平的檢測，最終發(fā)現(xiàn)TOX mRNA的表達(dá)水平顯著增高于慢性炎癥性疾病及正常皮膚組織，且MF斑塊期、腫瘤期的表達(dá)水平高于斑片期。另外指出TOX的表達(dá)水平與疾病進(jìn)程及預(yù)后有相關(guān)性，從而提出TOX mRNA的表達(dá)可作為對MF診斷及預(yù)后有用的一個(gè)標(biāo)記［8］。

隨后，Morimura等提出TOX是否可以作為不同亞型皮膚淋巴瘤腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物。他們采用免疫組化方法檢測了TOX在MF（斑片期、斑塊期、腫瘤期）、SS、淋巴瘤樣丘疹?。↙yP）、間變性大細(xì)胞型原發(fā)性皮膚淋巴瘤（PCALCL）、成人 T細(xì)胞淋巴瘤（ATLL）、外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）以及未分類型（NOS），同時(shí)檢測了特應(yīng)性皮炎（AD）及正常皮膚組織作為對照組。另外檢測了MF/SS的mRNA表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示TOX在MF、SS、PTCL、NOS中高表達(dá)（明顯的核著色），在LyP、PCALCL、ATLL中顯示核輕微著色。TOX mRNA在SS中的表達(dá)高于在MF中的表達(dá)。由此提出結(jié)論:TOX可能成為某些特定類型的皮膚淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞的特殊標(biāo)記物［7］。

本研究主要從蛋白表達(dá)水平來探究TOX能否作為MF的特異性分子標(biāo)記物，結(jié)果顯示MF組與對照組均有陽性表達(dá)，在MF中，隨病程進(jìn)展，表達(dá)增強(qiáng)（斑片期最高強(qiáng)度為++，斑塊期為+++，腫瘤期為++++），且陰性標(biāo)本均為斑片期。作為一種低度惡性的T細(xì)胞淋巴瘤，淋巴瘤樣丘疹病也有TOX表達(dá)，但蛋白表達(dá)強(qiáng)度較MF低。銀屑病及扁平苔癬作為炎癥性皮膚病，均有表達(dá)，蛋白表達(dá)強(qiáng)度較MF低。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示MF與對照組蛋白表達(dá)水平有顯著性差異，但若把TOX作為診斷MF的分子標(biāo)記物，或者早期MF與炎癥性皮膚病的鑒別診斷標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還不足以提供可靠證據(jù)，可能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

Notch信號通路被證實(shí)與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在卵巢癌、肝癌、腎細(xì)胞癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)過Notch的異常表達(dá)。Notch蛋白影響調(diào)控了血液及淋巴系統(tǒng)的部分功能，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中Notch1在胸腺中高表達(dá)，且在成人T細(xì)胞淋巴瘤中有突變的發(fā)生，并驗(yàn)證了Notch1在T細(xì)胞的分化階段中起一定作用［4，9，10］。Notch1基因編碼的Notch1蛋白是一種跨膜的蛋白受體，分為胞外段、跨膜區(qū)及胞內(nèi)段三部分，其中胞內(nèi)段即為 NICD。近年有很多學(xué)者對Notch1通路與成人T細(xì)胞白血病之間的關(guān)系進(jìn)行了多方面的研究，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在急性T細(xì)胞白血病中Notch1基因有突變，后來相繼對其他T細(xì)胞淋巴瘤中的Notch1表達(dá)做了研究，發(fā)現(xiàn)有異常表達(dá)。

以上研究均針對血液系統(tǒng)T細(xì)胞淋巴瘤，并沒有對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)研究［5，11-13］。我們的研究結(jié)果顯示MF組及對照組均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)Notch1蛋白的T細(xì)胞，僅有4例中性粒細(xì)胞表達(dá)Notch1。故本實(shí)驗(yàn)中Notch1蛋白并不在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，推測Notch信號通路可能不參與MF的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步結(jié)論還需更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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（收稿:2016-01-19 修回:2016-01-20）

TOX and Notch1 exPression in mycosis fungoides

ZHAO Jing1，2，ZHANG Furen2，WANG Jianwen2，CHEN Shengli2，ZHOU Guizhi2，LIU Yongxia2，CHEN Xuechao2，LU Xianmei2.

1.School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China；2.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，Jinan 250022，China Corresponding author:LU Xianmei，E-mail:xinmeilu2013@163.com

Objective:To detect the expression of TOX and Notch1 protein for mycosis fungoides（MF）and to determine the role as a potential molecular markers for MF.Methods:TOX and Notch1 protein were detected by immunohistochemical staining in the lesions of 35 patients with MF（15 patients at patch stage，10 at plaque stage and 10 at tumour stage）and in 45 controls（15 patients with lymphomatoid papulosis，15 with lichen planus and 15 with psoriasis）.Results:The positivity rate of TOX in the patients with MF was 94.3% and 76%in controls.The level of TOX protein expression was higher in MF patients than in controls（P＜0.05）.Notch1 protein was negative in tumor cells of all MF patients and controls.Conclusion:Although TOX expression level was higher in MF patients，TOX protein can not be used as a potential molecular marker for MF and further experimental studies should be performed.Notch1 protein is not a molecular marker for MF.

cutaneous T-cell lymphomas；MF；TOX；Notch signaling pathways；Notch1

1濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250000
2山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

盧憲梅，E-mail:xinmeilu2013@163.com

因早期MF（eMF）臨床及病理表現(xiàn)與良性炎癥性皮膚病常常難以鑒別，故本實(shí)驗(yàn)選擇具有典型病理表現(xiàn)的扁平苔蘚及銀屑病作為對照組；淋巴瘤樣丘疹?。↙yP）與MF很難區(qū)分［6］，為了比較廣泛的驗(yàn)證TOX及Notch1是否是MF特異性的分子標(biāo)記物，故也把淋巴瘤樣丘疹病作為對照組。