陳紫丹，邱業(yè)先，吳 瓊

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

陽澄湖與太湖微生物多樣性與群落結(jié)構(gòu)研究

陳紫丹，邱業(yè)先*，吳 瓊

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

以不同季節(jié)的陽澄湖、太湖的水樣和底泥為研究對象，采用PCR、T-RFLP技術(shù)結(jié)合的方式研究了兩湖水樣和底泥中微生物多樣性與群落結(jié)構(gòu)，從微生物角度出發(fā)分析引發(fā)陽澄湖、太湖養(yǎng)殖的螃蟹重大差異的原因。結(jié)果表明：春季兩湖水體環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)差異不顯著，底泥環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)差異甚大，夏季兩湖水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)跟春季相比都發(fā)生了較大變化，底泥相比春季變化不大。陽澄湖水樣的細(xì)菌群落優(yōu)勢度高于太湖水樣，群落內(nèi)物種分布相對均勻，其物種多樣性也較高?？赡苡捎趦珊w微生物和底泥微生物種群和多樣性的差異，影響了蟹的生長環(huán)境與營養(yǎng)，從而導(dǎo)致了兩湖蟹養(yǎng)殖上的差異，即陽澄湖水體與底泥微生物為螃蟹的養(yǎng)殖與生長提供了更為良好的環(huán)境。

微生物；多樣性；群落結(jié)構(gòu)；T-RFLP技術(shù)

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，從分子水平對微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究已經(jīng)成為可能［1］。末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析 （terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）就是在PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微生物群落分析的最新技術(shù)之一［2］。這種技術(shù)可有效地用于微生物菌種鑒定、群落的對比和多樣性分析［3-4］。由于具有相對高的分辨率和可重復(fù)性［5-6］，T-RFLP技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來解析環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)［7-10］。為了探索不同水體底泥環(huán)境養(yǎng)殖螃蟹的質(zhì)量區(qū)別，筆者采用T-RFLP技術(shù)研究了不同季節(jié)蘇州太湖和陽澄湖湖水及底泥微生物多樣性與群落結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 春夏樣品采集

2014年3月26、27日，底泥樣品及水樣用沉積物柱狀采樣器用五點(diǎn)采樣法分別采自江蘇省蘇州陽澄湖（31°29′24″N，120°49′21″E）、東太湖（31°10′20″N，120°31′28″E）。采集的樣品于冷藏條件下2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4℃冰箱保存。7月15、16日，同樣方法同一采集地點(diǎn)，取回陽澄湖和太湖水樣和底泥樣品。

1.2 DNA提取

1.2.1 底泥總DNA提取

稱取3 g底泥樣品，用Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取底泥中DNA，具體操作步驟見試劑盒說明書。為減少DNA提取過程中產(chǎn)生的偏差，抽提重復(fù)三次，將三次提取得到的DNA混合到一起。提取的DNA置于4℃保存。

1.2.2 水樣中總DNA提取

取水樣15 mL，加3 M醋酸鈉1.5 mL、33 mL無水乙醇，靜置于-20℃冰箱3 d后，于5 500 rpm，7℃冷凍離心35 min。用Dzup基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA，具體操作步驟見試劑盒說明書。為減少DNA提取過程中產(chǎn)生的偏差，抽提重復(fù)三次，將三次提取得到的DNA混合到一起。提取的DNA置于4℃保存。

1.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以提取的底泥樣品及水樣總DNA分別為模板，采用下列引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列：

其中正向引物5'端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標(biāo)記，引物由上海生工生物工程有限公司合成并標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系25 μL，其中1 μL Primer1（FAM-8F）、1 μL Primer2（1492R）、12.5 μL 2×Taq MasterMix、1 μL模板DNA，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。陰性對照用1 μL ddH2O代替模板DNA［11］。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s；55℃退火40 s，72℃延伸90 s，30次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.4 16S rDNA PCR產(chǎn)物的純化與限制性酶切

PCR反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用無菌刀片割取目的條帶后使用膠回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司）回收PCR產(chǎn)物。具體操作步驟見試劑盒說明書。采用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切體系30 μL，其中2 μL Fast Digest HhaⅠ、2 μL 10×Fast Digest Buffer、26 μL模板DNA。酶切條件為37℃反應(yīng)1 h，65℃終止反應(yīng)20 min。

1.5 末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）分析

將酶切產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因掃描，得到T-RFLP圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

不同季節(jié)不同樣品16S rDNA的基因擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1、圖2所示，從圖中可以看到擴(kuò)增片段為單一明亮清晰的條帶，其大小在1 700 bp左右。

圖1 春季不同樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

圖2 夏季不同樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

2.2 酶切圖譜

不同季節(jié)的兩湖底泥和水樣基因組DNA酶切圖譜如圖3、圖4所示，圖中A、B、C、D分別指太湖底泥、太湖水樣、陽澄湖底泥、陽澄湖水樣的酶切圖譜。

春季兩湖底泥和水樣中優(yōu)勢菌群的種類及其變化見表1。夏季兩湖底泥和水樣中優(yōu)勢菌群的種類及其變化見表2。

圖3 春季太湖底泥、太湖水樣、陽澄湖底泥、陽澄湖水樣細(xì)菌群落多樣性酶切圖譜

圖4 夏季太湖底泥、太湖水樣、陽澄湖底泥、陽澄湖水樣細(xì)菌群落多樣性酶切圖譜

表1 春季兩湖底泥和水樣中優(yōu)勢菌群的種類及其變化

表2 夏季兩湖底泥和水樣中優(yōu)勢菌群的種類及其變化

根據(jù)表1、表2得出春夏兩季兩湖不同樣品中細(xì)菌T-RF比例如圖5、圖6所示。

圖5 春季兩湖不同樣品中細(xì)菌T-RF比例圖

圖6 夏季兩湖不同樣品中細(xì)菌T-RF比例圖

從表1和圖5中可以看出，在春季樣品中，無論是陽澄湖還是太湖，其水樣和底泥樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)各不相同，每個樣本中所含優(yōu)勢菌也有所不同，陽澄湖水樣中的細(xì)菌優(yōu)勢種群T-RF分別為67 bp、187 bp、225 bp、244 bp，所占比例分別為23.97%、14.67%、19.85%、13.57%；太湖水樣中的細(xì)菌優(yōu)勢種群T-RF分別為67 bp、187 bp、186 bp、224 bp，所占比例分別為16.12%、10.35%、14.86%、12.37%。太湖底泥中的細(xì)菌優(yōu)勢種群T-RF分別為67 bp、188 bp、211 bp、225 bp，所占比例分別為19.38%、15.59%、11.01%、10.17%，陽澄湖底泥中的優(yōu)勢種群比例超過10%的T-RF長度分別為79 bp、92 bp、205 bp，所占比例分別為11.46%、12.49%、11.03%，其他種群所占比例都較小，因此，這些種群可能為陽澄湖底泥中的優(yōu)勢種群。

從表2和圖6中可以看出，陽澄湖水樣中優(yōu)勢T-RF分別為106 bp、116 bp、163 bp，所占比例分別為12.32%、11.7%、13.89%；太湖水樣中，優(yōu)勢T-RF分別為67 bp、162 bp、172 bp，所占比例分別為23.65%、17.3%、8.15%；陽澄湖底泥中，優(yōu)勢T-RF分別為67 bp、116 bp、132 bp、180 bp，所占比例分別為18.02%、6.39%、11.49%、8.07%；太湖底泥中，優(yōu)勢T-RF分別為67 bp、221 bp、225 bp、244 bp，所占比例分別為14.74%、9.72%、13.62%、11.57%。

從圖4和圖5中可以看出，兩湖樣品中夏季較之春季的微生物多樣性有了明顯增強(qiáng)，這與夏季溫度升高有關(guān)，溫度是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一，在一定溫度范圍內(nèi)，機(jī)體的代謝活動與生長繁殖隨著溫度的上升而增加［12］。

綜上所述，春季兩湖水樣中的優(yōu)勢種群差別不明顯，說明春季兩湖水體環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)類似。而底泥環(huán)境中，陽澄湖底泥中的優(yōu)勢T-RF片段均未在太湖底泥中檢測到，兩湖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)差別較大。到了夏季，兩湖的底泥水樣中優(yōu)勢T-RF片段與春季相比都有了很大變化，有些片段已經(jīng)檢測不到，更多新的優(yōu)勢片段顯示出來。這可能是隨著季節(jié)更替，水體和底泥微生物均隨著環(huán)境的變化而變化［13］。

2.3 陽澄湖與太湖細(xì)菌多樣性比較分析

不同季節(jié)不同樣品中香濃指數(shù)變化見圖7。從圖7中的香濃指數(shù)變化可以看出，春夏兩季，兩湖水樣底泥中的香濃指數(shù)總體保持夏季香濃指數(shù)較大的趨勢。香農(nóng)指數(shù)表明細(xì)菌群落多樣性越高，香濃指數(shù)值越大［17］。春季陽澄湖底泥的細(xì)菌群落多樣性最大，太湖底泥相對次之。陽澄湖和太湖水樣的細(xì)菌多樣性也表現(xiàn)出這樣的規(guī)律。夏季陽澄湖水樣的群落多樣性最大，而太湖水樣次之，兩湖底泥差別不明顯。兩湖水樣中的群落多樣性隨著季節(jié)變化的趨勢較大，底泥則變化不大，陽澄湖底泥甚至沒有變化。

不同季節(jié)不同樣品辛普森指數(shù)變化見圖8。圖8的辛普森指數(shù)變化顯示，春季無論是陽澄湖或是太湖的底泥還是水樣，其辛普森指數(shù)都存在明顯差異，陽澄湖的底泥和水樣中細(xì)菌群落優(yōu)勢度指數(shù)均明顯高于太湖的底泥和水樣。夏季，陽澄湖水樣和太湖水樣的群落優(yōu)勢度明顯高于春季，而兩湖底泥的群落優(yōu)勢度的變化則微乎甚微。陽澄湖水樣的群落優(yōu)勢度高于太湖水樣，群落內(nèi)物種分布相對均勻，其物種多樣性也較高［18］。

圖7 不同季節(jié)不同樣品中香濃指數(shù)變化

圖8 不同季節(jié)不同樣品辛普森指數(shù)變化

有研究表明［19］，陽澄湖蟹可食部分礦物質(zhì)元素大于太湖蟹，其含量分別為，雌性群體：9 983 mg·kg-1、7 599 mg·kg-1，雄性個體：7 833.24 mg·kg-1、7 501 mg·kg-1。陽澄湖清水大閘蟹享有“蟹中之王”的美稱，其外形青背、白肚、黃毛、金爪，顏色鮮明，無雜色，而且體大膘肥，口感上肉質(zhì)白嫩，蟹黃多，也是其他太湖區(qū)蟹無法比擬的。其原因在于陽澄湖有更好的水質(zhì)，更適合各種微生物生長，也更適合孕育更鮮美的螃蟹。

3 結(jié)語

（1）隨著季節(jié)的更替，春夏兩季兩湖的水樣底泥中優(yōu)勢菌種片段發(fā)生了巨大變化。有些優(yōu)勢T-RF片段檢測不到，有其他新的優(yōu)勢T-RF片段顯現(xiàn)出來。

（2）分析兩湖不同季節(jié)香濃指數(shù)可知，兩湖水樣中的群落多樣性隨著季節(jié)變化的趨勢較大，底泥則變化不大，陽澄湖底泥的變化微乎其微。

（3）分析兩湖不同季節(jié)辛普森指數(shù)可知，陽澄湖水樣和太湖水樣夏季的群落優(yōu)勢度明顯高于春季。而陽澄湖水樣在春夏兩季其群落優(yōu)勢度均高于太湖水樣，群落內(nèi)物種分布相對均勻，其物種多樣性也較高，其中的微生物結(jié)構(gòu)組成更為和諧，種間競爭也更為平衡，從而給陽澄湖的螃蟹提供了更為良好的生長環(huán)境。

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責(zé)任編輯：李文杰

Comparative study on the microbial diversity and community structure in Yangcheng Lake and Tai Lake

CHEN Zidan，QIU Yexian，WU Qiong
（School of Chemistry，Biology and Material Engineering，SUST，Suzhou 215009，China）

Based on the water and bottom sludge samples of Yangcheng Lake and Tai Lake，we investigated the microbial diversity and community structure with the PCR and T-RFLP methods in order to analyze the reasons for the significant difference of the crabs bred in the two lakes from the microbiological perspective.The results indicate that the microbial diversity and community structure in the water of two lakes have no significant difference in spring，but do have much difference in summer.The difference is significant in the bottom sludge of the two lakes in spring while it is small in summer.Community structure of bacteria in the water of Yangcheng Lake is more harmonious than that of Tai Lake.In Yangcheng Lake，the distribution of species is relatively uniform and the microbial diversity is also better.These all have an effect on the crab breeding.Thus，the environment of grown for crabs is relatively better in Yangcheng Lake.

microorganism；diversity；community structure；technology of T-RFLP

X172

A

1672-0687（2016）02-0035-06

2015-03-06

陳紫丹（1989-），女，新疆阿克蘇人，碩士研究生，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化工程。

*通信聯(lián)系人：邱業(yè)先（1954-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，E-mail：qyx542@163.com