劉世軍，趙海峰，唐志書△，崔春利，梁艷妮，劉紅波，張　娛1陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室；3陜西省風濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心

正交設(shè)計法優(yōu)選補陽還五膠囊提取工藝*

劉世軍1，2，3，趙海峰1，2，3，唐志書1，2，3△，崔春利1，2，3，梁艷妮1，2，3，劉紅波1，2，3，張娛1，2，3
1陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室；3陜西省風濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心

目的：優(yōu)選補陽還五膠囊（黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁）的水提工藝。方法：采用L9（34）正交設(shè)計法，以加水量、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，以黃芪甲苷的含量、浸膏得率2個指標為考察指標。結(jié)果：最佳水提工藝是第一次加10倍量水先浸泡1小時，再煎煮2小時，第二、三次各加入8倍量的水，各煎煮1.5小時為宜。結(jié)論：優(yōu)選的補陽還五膠囊水提取工藝穩(wěn)定可行。

補陽還五膠囊；正交設(shè)計；黃芪甲苷；薄層掃描

補陽還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，有補氣、活血、祛瘀通絡(luò)之功效［1］，目前已有關(guān)于糖漿劑、口服液、注射劑、沖劑［2］的工藝研究以及劑型改革初探［3］的報道。本實驗采用L9（34）正交設(shè)計，以君藥黃芪中所含的黃芪甲苷含量以及浸膏得率為指標，以加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，優(yōu)選提取工藝，最大限度地保留其有效成分，以便更好地應(yīng)用于臨床。

1　儀器與試藥

C S-9301型薄層掃描儀（日本島津），黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：781-200210）。D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5c m）。水為純化水，其余試劑均為分析純。M erc k公司生產(chǎn)的預(yù)制板（10 c m×20 c m），展開劑：氯仿-甲醇-水（13∶6∶2）10℃以下放置過夜的下層溶液，飽和15分鐘展開。顯色劑：10%硫酸乙醇溶液，105℃烘5分鐘。雙波長反射法鋸齒掃描：λs=530 n m，λR=700 n m。

2　方法與結(jié)果

2.1正交工藝設(shè)計［4］采用L9（34）正交實驗。根據(jù)文獻資料及大生產(chǎn)的實際情況，對影響水提的主要因素加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）等主要影響因素進行考察，實驗因素水平見表1。按處方比例稱取藥材，按正交實驗表安排實驗。

表1　因素水平

2.2樣品制備稱黃芪120g，當歸6g，赤芍5g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g共6味藥，每份140 g，稱取9份。按L9（34）實驗方案，進行實驗。將藥材置于燒瓶中，先浸泡1小時后再煎煮提取，濾過，合并濾液，濃縮至適量，最后得1～9號提取液并定容于100mL量瓶中，備用。

2.3薄層掃描法測定黃芪甲苷的含量［5］

2.3.1對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液（實際0.49mg/mL），黃芪甲苷對照品2.45mg，溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶內(nèi)，加甲醇至刻度，作為對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備分別精密吸取上述正交實驗的1～9號樣品10 mL轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，20mL/次，合并正丁醇提取液，用氨試液提取2次，20mL/次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 c m，長12 c m），以水50mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30mL洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2mL量瓶內(nèi)，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.3陰性對照溶液的制備按處方比例分別稱取除黃芪以外的其余藥味，按照制備工藝制成缺黃芪的陰性樣品，按“2.3.2”項供試品溶液的制備方法操作，制成陰性樣品溶液。

2.3.4專屬性實驗分別取供試品溶液及陰性供試品溶液，氯仿-甲醇-水（13∶6∶2）10℃以下放置過夜的下層溶液，飽和15分鐘展開，10%硫酸乙醇溶液顯色，105℃烘5分鐘，雙波長反射法鋸齒掃描：λs=530 n m，λR=700 n m。按上述條件分析，陰性樣品在指標成分黃芪甲苷的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好。

2.3.5標準曲線及線性范圍分別精密吸取對照品溶液（C=0.49 mg/mL）2、4、6、8、10、12、14μL，按上述色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表2。

表2　標準曲線實驗結(jié)果

以峰面積A為縱坐標，黃芪甲苷含量C（μg）為橫坐標計算回歸方程為：A=1 111.84C+300.27，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍0.980～6.860μg。標準曲線（見圖1）。

圖1　黃芪甲苷標準曲線

2.3.6精密度實驗

2.3.6.1同板精密度精密吸取3號供試品5μL，同板點樣5次，記錄峰面積，RS D為1.49%，表明本方法同板精密度良好。

2.3.6.2異板精密度精密吸取3號供試品5μL，異板點樣5次，記錄峰面積，RS D為1.34%，表明本方法異板精密度良好。

2.3.7重復(fù)性實驗精密吸取3號提取液5份，按供試品制備方法制備，點樣5μL，記錄峰面積、計算含量，RS D為1.40%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8穩(wěn)定性實驗取3號供試品，按供試品制備方法制備樣品，分別在0、0.5、1、1.5、2小時記錄峰面積并計算出RS D為0.55%。表明供試品在2小時內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.9回收率實驗取3號正交樣品適量，加適量對照品，按供試品制備方法制備樣品，測定含量，測定含量計算回收率，表明本方法回收率良好，結(jié)果見表3。

表3　回收率實驗結(jié)果

2.3.10樣品測定按供試品制備方法處理1～9號樣品，依色譜條件測定其含量，結(jié)果見表4。

2.4總提取物的測定將1～9號提取物分別濃縮后定容于100mL量瓶中，搖勻，分別精密量取25mL，置于在105℃條件下干燥至恒重的蒸發(fā)器中，烘干至恒重，計算出總提取物（%），結(jié)果見表4。

表4　正交實驗結(jié)果

2.5正交實驗結(jié)果與分析從表4實驗結(jié)果可以看出，對兩個考察指標影響最大的均為因素C，以總提物為考察指標來看，可以認為各因素對總提取物的影響大小順序為C＞B＞A，再從各因素水平來看（K值分析），3個因素均為K3＞K2＞K1，以黃芪甲苷含量為考察指標來看，可以認為各因素對黃芪甲苷含量的影響大小順序為C＞A＞B，從各因素水平來看（K值分析）因素A為K3＞K1＞K2，因素B、C為K3＞K2＞K1，從以上直觀分析其水提條件應(yīng)為A3B3C3，實驗結(jié)果及直觀分析詳見表4。

2.6正交實驗方差分析結(jié)果考慮到大生產(chǎn)實際情況，有必要對各因素水平的顯著性進行方差分析，表5方差分析結(jié)果表明，因素A、B、C對黃芪甲苷的含量均有顯著性影響。表6方差分析結(jié)果表明，因素C、B對總提物有顯著性影響，因素A幾乎無影響，結(jié)合表4的直觀分析，其優(yōu)選工藝為A3B3C3，其工藝為第1次加10倍量水先浸泡1小時，再煎煮2小時，第二、三次各加入8倍量的水，各煎煮1.5小時為宜。見表5—6。

表5　黃芪甲苷方差分析

表6　出膏率含量方差分析

3　討論

3.1指標成分的選擇補陽還五膠囊為中藥復(fù)方制劑，由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁7味中藥組成。含量測定時應(yīng)首選君藥，本品君藥為黃芪?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其所含黃芪甲苷是主要活性成分和質(zhì)量控制的指標性成分，能提高人體免疫力，具有抗疲勞、抗衰老，擴張血管和擴張冠脈作用。上述作用與中醫(yī)傳統(tǒng)理論黃芪補氣固表相契合，因此，以君藥中有效成分作為指標有助于全面地評價提取工藝。

3.2薄層掃描方法的選擇目前對于含黃芪制劑的含量測定研究，主要針對黃芪甲苷。黃芪甲苷含量測定的方法較多，主要有薄層掃描法和高效液相色譜法，筆者采用了較成熟的薄層掃描法，經(jīng)過方法學(xué)考察表明，制定的測定方法重現(xiàn)性、精密度均良好，回收率等符合要求，整個實驗過程可操作性強，能夠客觀地控制本品的含量。

3.3實驗結(jié)果分析本實驗通過正交設(shè)計優(yōu)選的補陽還五膠囊最佳提取工藝為：第1次加10倍量水先浸泡1小時，再煎煮2小時，第二、三次各加入8倍量的水，各煎煮1.5小時為宜。這為該制劑的提取工藝參數(shù)確定提供了實驗依據(jù)，為該制劑中藥新藥的開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］ 鄧中甲.方劑學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：240.

［2］ 張德連，邵碧霞，史瑞書，等.補陽還五沖劑工藝的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，1997，10（2）：81-82.

［3］ 劉世軍，熊英.補陽還五湯劑型改革初探［J］.甘肅中醫(yī)，2009，22（6）：61-62.

［4］ 張丕德，龍曉英.正交設(shè)計與數(shù)據(jù)分析在藥學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2009，25（5）：546-551.

［5］ 梁溢，陳幸，黎萬壽，等.還伍膠囊中黃芪甲苷的定量分析［J］.中成藥，2004，26（5）：430-431.

Optim ization of Extraction Processof BuYang HuanWu Capsulesby OrthogonalDesign

LIU Shijun1，2，3，ZHAO Haifeng1，2，3，TANG Zhishu1，2，3△，CUIChunli1，2，3，LIANG Yanni1，2，3，LIU Hongbo1，2，3，ZHANG Yu1，2，3
1 ShaanxiCollaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resource Industrialization of ShaanxiUniversity of Chinese Medicine，Xianyang 712083，China；2 Shaanxi Provincial Key Lab of the Study for Traditional Chinese Medicine and New Drugs；3 Shaanxi Provincial Engineering Research Center of Rheumatism and Tumor Chinese Drugs Preparation

Objective：To optim ize water extraction technology of BuYang HuanWu capsules［HuangQi Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bunge.），DangGui（Angelica sine），ChiShao （Radix Paeoniae Rubra），DiLong （earthworm），ChuanXiong（Ligusticum chuanxiong Hort.），HongHua（Carthamus tinctorius L.），TaoRen（Prunus persica （L.）Batsch）］.Methods：L9（34）orthogonaldesign wasadopted by takingwatervolume，extraction time and extraction timesas the factors，containing quantity and extractyield as the indexes.Results：The optimalwater extraction technology is to soak forone hoursafteradding thewater in ten timesat the first time，decocting for two hours，decocting for 1.5 hours respectively after adding thewater in eight times at the second and third times.Conclusion：The optim izedwaterextraction of BuYang HuanWu capsules is stable and feasible.

BuYang HuanWu capsules；orthogonaldesign；astragaloside IV；TLC

R284.2

A

1004-6852（2016）04-0032-04

2015-02-19

陜西省重點科技創(chuàng)新團隊計劃（編號2012KCT-20）。

劉世軍（1974—），男，博士學(xué)位，高級工程師。研究方向：天然產(chǎn)物分離，中藥鑒定，中藥制劑工藝與質(zhì)量標準研究。

唐志書（1972—），男，博士學(xué)位，碩士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：中藥高新制備技術(shù)應(yīng)用研究及中藥資源開發(fā)與綜合利用。