馬 新，姜 偉，，朱長(zhǎng)軍

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京 100021；2.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14細(xì)胞內(nèi)中小體定位的研究

馬 新1，姜 偉1，2，朱長(zhǎng)軍2

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京 100021；2.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

為了探討決定人體驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14在細(xì)胞有絲分裂末期時(shí)定位于細(xì)胞中小體的功能域，構(gòu)建了驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14各功能域的綠色熒光蛋白（GFP）真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染于人體子宮頸癌細(xì)胞HeLa中.應(yīng)用聚丙烯酰氨凝膠電泳和免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況；應(yīng)用免疫熒光染色法（immunofluorescence）分別對(duì)微管蛋白（Tubulin）、著絲粒相關(guān)蛋白（CREST）和DNA染色，熒光顯微鏡下觀察各綠色熒光融合蛋白在有絲分裂末期的亞細(xì)胞定位.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞有絲分裂末期，驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14的N末端GFP融合蛋白定位于中小體（midbody），馬達(dá)區(qū)GFP融合蛋白沿微管分布，桿狀尾區(qū)GFP融合蛋白以點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)，尾區(qū)GFP融合蛋白分布于整個(gè)細(xì)胞中.由此認(rèn)為，Kif14驅(qū)動(dòng)蛋白分子的N末端延伸區(qū)決定該蛋白分子在細(xì)胞有絲分裂末期定位于中小體.

驅(qū)動(dòng)蛋白；Kif14；有絲分裂末期；中小體

驅(qū)動(dòng)蛋白超家族是一類具有ATP水解酶活性、以微管為軌道定向運(yùn)動(dòng)的馬達(dá)蛋白［1-2］，它們參與調(diào)控細(xì)胞的基本生命活動(dòng)過(guò)程.驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14（kinesin family member 14）屬于Kinesin-3亞家族［3］，它對(duì)于機(jī)體順利完成細(xì)胞有絲分裂、維持基因組穩(wěn)定性以及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸具有重要作用［4］.在細(xì)胞有絲分裂末期，Kif14對(duì)于順利形成中小體以及最后的細(xì)胞分裂至關(guān)重要，應(yīng)用siRNA干涉Kif14時(shí)，細(xì)胞不能形成完整中小體，并且無(wú)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行最后切割，最終會(huì)形成多核細(xì)胞［5-6］.了解驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14各功能域在細(xì)胞有絲分裂末期的具體作用，將有助于闡明細(xì)胞有絲分裂末期的切割機(jī)制，但首先要明確Kif14各結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞有絲分裂末期的定位.

本研究通過(guò)構(gòu)建Kif14不同功能域的綠色熒光蛋白真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后觀察各功能域在細(xì)胞有絲分裂末期的綠色熒光融合蛋白的定位，探討決定Kif14在細(xì)胞有絲分裂末期定位的功能域.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

pEGFPC1真核表達(dá)載體、pEGFPC1-Kif14真核表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室自存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；人子宮頸癌細(xì)胞HeLa為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株.

1.1.2 主要試劑

高保真PCR Taq酶（日本東洋紡公司）；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ以及轉(zhuǎn)染試劑Turbofect（美國(guó)Fermentas公司）；細(xì)胞完全培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清和胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；鼠抗Tubulin抗體、CREST、FITC或Texas Red標(biāo)記的羊抗二抗和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國(guó)Invitrogen公司）；T4 DNA連接酶和DNA Marker（大連寶生物公司）；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.DNA序列測(cè)定和引物合成均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成.

1.1.3 主要儀器

Mycycler普通PCR儀、miniPROTEAN tera system小型蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司）；ECLIPSE TS100倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）.

1.2 方法

1.2.1 Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)Kif14各功能域的上下游引物，如表1所示.以pEGFPC1-Kif14質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增各功能域核酸序列，經(jīng)過(guò)凝膠回收后，用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后再次回收.回收產(chǎn)物與已被限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后的載體pEGFPC1以適當(dāng)比例用T4 DNA連接酶室溫連接4 h，將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，小量提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定.將初步鑒定正確的質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將人體子宮頸癌細(xì)胞HeLa接種于24孔板，每孔接種40 000個(gè)細(xì)胞，每孔含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基500 μL，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁或爬片后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染.使用Turbofect作為轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染100 ng已構(gòu)建好的Kif14各功能域質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等劑量的pEGFPC1空載體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在熒光顯微鏡下觀察是否表達(dá)綠色熒光蛋白.

表1 Kif14各功能域上下游引物Tab.1 Upstream and downstream primers of each functional domain in Kif14

1.2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

在24孔板中，各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，刮取細(xì)胞，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的SDS buffer（SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，甘油體積分?jǐn)?shù)為10%，Tris-Cl濃度為50 mmol/L，pH為6.8，β-巰基乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%，溴酚藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%）裂解細(xì)胞，得到全細(xì)胞裂解液.取20 μL上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%，恒定電流為35 mA，分離蛋白質(zhì)1 h之后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用質(zhì)量濃度為50 mg/mL的脫脂奶粉（TBS?。┓忾]30 min后，以兔抗GFP為一抗室溫孵育2 h，以偶聯(lián)了辣根過(guò)氧化物酶的羊抗兔抗體為二抗室溫孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（ECL）反應(yīng)2 min，暗室內(nèi)顯影.

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色

在24孔板中，爬片細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的比率超過(guò)60%即可進(jìn)行免疫熒光染色.取出爬片后用PBS洗3次，每次5 min，采用福爾馬林固定液（含有體積分?jǐn)?shù)為3%的甲醛、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖的PBS緩沖液）固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，甘氨酸終止5 min.用體積分?jǐn)?shù)為10%的山羊血清（山羊血清體積分?jǐn)?shù)為10%、TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的PBS緩沖液）封閉30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PBS-TX洗3次，每次5 min.加入鼠抗Tubulin抗體和CREST室溫孵育4 h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PBS-TX洗3次，每次5 min.加入Texas Red標(biāo)記的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗避光孵育2 h后加入DAPI，室溫避光3 min.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的PBS-TX洗3次，每次5 min，加入抗淬滅劑后封片.

2 結(jié)果

2.1 Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

Kif14的結(jié)構(gòu)模式圖和已構(gòu)建各功能域的模式圖如圖1（a）所示.構(gòu)建的GFP重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFPKif14N356、pEGFP-Kif14Motor、pEGFP-Kif14C940和pEGFP-Kif14C416分別用限制性內(nèi)切酶 SalⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定.瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明，Kif14各功能域目的片段均已成功插入載體中，如圖1（b）所示.測(cè)序后，經(jīng)與NCBI公布序列比對(duì)，DNA序列信息完全相同，讀碼框正確，證明已成功構(gòu)建了各功能域重組質(zhì)粒.

圖1 Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of GFP-expressing plasmids of Kif14 domains

2.2 Kif14各功能域綠色熒光蛋白的表達(dá)及在細(xì)胞有絲分裂末期的細(xì)胞內(nèi)定位

將構(gòu)建成功的Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，獲得全細(xì)胞裂解液，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，各個(gè)融合蛋白均有表達(dá)，且蛋白相對(duì)分子質(zhì)量與理論值相符.應(yīng)用免疫熒光對(duì)已轉(zhuǎn)染的各重組質(zhì)粒細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察各功能域的細(xì)胞內(nèi)定位，結(jié)果如圖3所示.在細(xì)胞有絲分裂末期，Kif14的N末端延伸區(qū)集中定位于中小體上，馬達(dá)區(qū)綠色熒光沿微管分布，桿狀尾區(qū)綠色熒光以點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，尾區(qū)綠色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞中.

圖2 Kif14各功能域綠色熒光融合蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of GFP fusion protein of Kif14 domains

3 討論

Kif14基因位于人染色體1q32.1上，該基因編碼1648個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約為1.865×105（186.5kDa），1994年由Nomura等［7］從骨髓細(xì)胞cDNA文庫(kù)中首次克隆.Kif14蛋白最先被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中姐妹染色體的整列［8］，隨后研究發(fā)現(xiàn)Kif14在胞質(zhì)分裂過(guò)程中也起重要作用［5-6，9］.應(yīng)用RNAi敲降Kif14發(fā)現(xiàn)，敲降效率達(dá)到80%以上時(shí)，細(xì)胞明顯出現(xiàn)多倍性.缺失Kif14細(xì)胞不能有效完成胞質(zhì)分裂后期事件，破壞細(xì)胞周期進(jìn)程，最終引起胞質(zhì)分裂失敗，呈現(xiàn)雙核或多核細(xì)胞［1］.免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)，Kif14在間期定位于細(xì)胞質(zhì)中，有絲分裂前中期至中期階段，部分Kif14彌散于細(xì)胞質(zhì)中，部分定位于紡錘體兩極和紡錘體上；進(jìn)入后期，Kif14集中定位于紡錘體中央?yún)^(qū)和分裂溝上，隨著有絲分裂進(jìn)入末期，大量Kif14定位于中小體上［1，5，10］.Citron kinase是一種能與RhoA蛋白分子相互作用的蛋白激酶［11］，在有絲分裂后期定位于分裂溝上，末期定位于中小體上，參與調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂［12-14］.免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Kif14和Citron kinase在有絲分裂后期共定位于分裂溝上，末期共定位于中小體上［10］.Kif14和Citron kinase之間的相互作用使Citron kinase能夠及時(shí)從分裂溝轉(zhuǎn)移到中小體，而Kif14由分裂溝向中小體的聚集和保持也依賴Citron kinase［6］.RNAi無(wú)論干涉Kif14還是Citronkinase，細(xì)胞都不能對(duì)不完整的中小體進(jìn)行最后切割，最終形成多核細(xì)胞.然而，Kif14在最后的中小體切割過(guò)程中的具體作用和機(jī)制還不明確，因此，研究確定Kif14在有絲分裂末期定位的功能域?qū)﹃U明最后的中小體切割機(jī)制至關(guān)重要.

本研究通過(guò)構(gòu)建Kif14不同功能域的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有絲分裂末期，驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif14的N末端延伸區(qū)綠色熒光定位于中小體，馬達(dá)區(qū)綠色熒光沿微管分布，桿狀尾區(qū)綠色熒光以點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)，尾區(qū)綠色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞中.實(shí)驗(yàn)表明：外源蛋白只要含有Kif14的N末端延伸結(jié)構(gòu)域，就可以在有絲分裂末期定位于中小體上；相反，其他功能域蛋白不含有Kif14的N末端延伸結(jié)構(gòu)域，就不能在有絲分裂末期定位于中小體上.因此，本研究認(rèn)為決定Kif14在有絲分裂末期定位于中小體的功能域是N末端延伸結(jié)構(gòu)域.

臨床研究顯示，Kif14在多種腫瘤中存在基因擴(kuò)增和高表達(dá)現(xiàn)象［2，15-17］，并且與腫瘤的病理分級(jí)、預(yù)后密切相關(guān)，這表明Kif14可作為多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物［18-21］.研究Kif14的分子功能機(jī)制將對(duì)尋找新的藥物靶點(diǎn)、有效治療惡性腫瘤提供新的思路.

圖3 細(xì)胞有絲分裂末期Kif14各功能域的定位Fig.3 Localization of Kif14 domains in telophase cells

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（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）

Study on intracellular midbody localization of kinesin moter protein Kif14

MA Xin1，JIANG Wei1，2，ZHU Changjun2
（1.Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China；2.College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To study the domain of Kif14 that determines its midbody localization in telophase in eukaryotic cells，the green fluorescent protein（GFP）expression plasmids for different Kif14 domains were constructed and transfected into HeLa cells respectively.The expression of GFP-fused proteins were detected by Western Blot and the localization of these proteins was detected by immunofluorescence staining.The results showed that the GFP-fused N-terminal extension domain of Kif14 locates in midbody in telophase，GFP-fused motor domain distributes along the microtubule，GFP-fused stock and tail domain appears dots distribution in cytoplasm，and GFP-fused tail region distributes throughout the cell.In conclusion，N-terminal extension of Kif14 determines its localization in midbody in telophase.

kinesin；Kif14；telophase；midbody

Q966

A

1671-1114（2016）03-0054-05

2016-01-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（31271485）；2011年教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”資助項(xiàng)目（NCET-11-1066）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃一般資助項(xiàng)目（14JCYBJC24200）；天津市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金資助項(xiàng)目（14ZXCXSY00121）.

馬 新（1990—），女，碩士研究生.

朱長(zhǎng)軍（1974—），男，教授，主要從事細(xì)胞有絲分裂調(diào)控機(jī)制以及細(xì)胞骨架功能方面的研究.