田中原，王亞萍，劉 屾，任 毅，馮 欣，孫建華

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

堿性蛋白酶水解豆粕制備ACE抑制肽水解條件的優(yōu)化

田中原，王亞萍，劉 屾，任 毅，馮 欣，孫建華

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

為了尋求高效的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽制備方法，在實(shí)驗(yàn)室條件下利用堿性蛋白酶水解豆粕生產(chǎn)ACE抑制肽，并采用單因素和多因素實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)延長(zhǎng)堿性蛋白酶的水解時(shí)間和提高pH，可大幅度提高ACE抑制肽的抑制活性.單因素和多因素實(shí)驗(yàn)綜合結(jié)果顯示，堿性蛋白酶水解豆粕產(chǎn)生ACE抑制肽的適宜水解條件為：pH為9.0，水解溫度為50℃，水解時(shí)間為4h，蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（酶質(zhì)量/底物質(zhì)量）為2.0%，底物質(zhì)量濃度為40g/L，在此條件下制備的ACE抑制肽的抑制率可達(dá)到97.97%.

豆粕；ACE抑制肽；堿性蛋白酶；酶解條件；優(yōu)化

豆粕是大豆提取豆油后的副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量較高，一般為43%左右.其中，賴氨酸約為6.0%，色氨酸約為1.2%，亮氨酸約為9.4%［1］.利用酶解豆粕法可以制備食源性的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽［2］，它能夠抑制ACE的活性，從而實(shí)現(xiàn)降低血壓的功能，是一種潛在的降壓藥物［3］.ACE通過兩條途徑對(duì)血壓產(chǎn)生影響：一方面，ACE可以將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ，而血管緊張素Ⅱ能夠促進(jìn)血管收縮，導(dǎo)致血壓升高；另一方面，ACE作用于舒激肽使其失活，從而失去擴(kuò)張血管的作用，可以導(dǎo)致血壓升高［4］.若能夠抑制ACE的活性，就可以對(duì)高血壓進(jìn)行有效防治.傳統(tǒng)的化學(xué)合成降壓藥可有效抑制ACE的活性，但長(zhǎng)期服用具有副作用大的缺點(diǎn).食源性降壓肽雖然效果不如合成藥物，但其具有無副作用、溫和、安全的特點(diǎn)且不影響正常者的血壓.因此，食源性ACE抑制肽的研究備受關(guān)注，其應(yīng)用前景十分廣闊［5］.降壓肽的制備方法多種多樣：從原料看，包含多種動(dòng)植物原料及下腳料；從生產(chǎn)工藝區(qū)分又可分為發(fā)酵法［6］、自溶法［7］、酶解法［8］等.酶解法是目前最常用的制備方法，如使用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶制備降壓肽等.其中堿性蛋白酶水解產(chǎn)物具有較高的ACE抑制活性［9］.

本課題組前期研究結(jié)果表明，堿性蛋白酶水解豆粕產(chǎn)物的ACE抑制活性能夠隨著酶解條件的優(yōu)化有效提高至64.24%［10］.在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)堿性蛋白酶水解豆粕生產(chǎn)ACE抑制肽的酶解條件進(jìn)行更深入的優(yōu)化，旨在進(jìn)一步提高堿性蛋白酶水解豆粕產(chǎn)物的ACE抑制活性，以期為ACE抑制肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性蛋白酶（天津市諾奧科技發(fā)展有限公司）；食用級(jí)豆粕（市售）；硼酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；硼砂（分析純，天津市元立化工有限公司）；三氟乙酸（分析純，上海市科豐試劑廠）；甲醇（色譜純，美國迪馬科技公司）；馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）和ACE（ACE來自兔肺，美國Sigma公司）.

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水槽（DK-8D，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；加熱磁力攪拌器（EMS-8A，天津市歐諾儀器儀表有限公司）；pH計(jì)（PHS-3E，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；高效液相色譜儀（1200，美國安捷倫公司）；微型超聲波清洗器（KQ116，鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司）.

1.3 方法

1.3.1 酶解抑制肽樣品的制備

本研究主要考察pH、水解溫度、水解時(shí)間、酶濃度、底物濃度對(duì)堿性蛋白酶水解豆粕制備ACE抑制肽的影響.通過向體系中滴加1mol/L的NaOH溶液保持反應(yīng)體系pH值的恒定，同時(shí)記錄加入量，用于計(jì)算水解度.將取得的樣品溶液在4℃、12500 r/min條件下離心15min，吸取上清液.對(duì)上清液進(jìn)行冷凍干燥，然后制成ACE抑制肽粉末.將粉末用硼酸緩沖液（pH 8.3，含0.3 mol/L的NaCl）稀釋到一定濃度，測(cè)定其抑制活性.

1.3.2 堿性蛋白酶水解度的測(cè)定方法

采用Ph-STAT法［11］測(cè)定堿性蛋白酶的水解度.

1.3.3 ACE抑制肽活性的檢測(cè)方法

本研究采用HPLC法測(cè)定ACE抑制肽的活性.原理：以HHL為底物，ACE抑制肽為催化劑，通過檢測(cè)加入ACE抑制肽前后生成物馬尿酸的峰面積的差值，計(jì)算得到抑制率.該方法檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高［11］，既可測(cè)定天然源抑制肽，也可測(cè)定人工合成的抑制肽.

用0.45 μm的濾膜分別過濾質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和20.0 μg/mL的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，之后用高效液相色譜儀檢測(cè)，分別測(cè)得不同標(biāo)準(zhǔn)液的相對(duì)峰值，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：

式中：x為馬尿酸的質(zhì)量濃度（μg/mL）；y為峰面積（mAu·s）.

色譜分析條件：色譜柱為Zorbax300SB-C18型（5 μm，4.6 mm×150 mm，美國Agilent公司）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm；柱溫為26℃；流動(dòng)相為甲醇-超純水（體積比為1∶1），含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸；流速為0.7 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；時(shí)間為8 min.

測(cè)定管：取配置好的0.5 g/L的抑制肽樣品60μL 與10 μL的ACE溶液混合，37℃水浴10 min后，加入50 μL的HHL溶液.將反應(yīng)體系置于37℃水浴中反應(yīng)60 min后，加入100 μL的濃度為1 mol/L的HCl終止反應(yīng).而后將反應(yīng)液過0.45 μm的濾膜，再進(jìn)行液相色譜檢測(cè)分析.

對(duì)照管：用60 μL的硼酸緩沖液（pH為8.3，含0.3 mol/L的NaCl）替代抑制肽溶液.

空白對(duì)照：用70 μL的硼酸緩沖液（pH為8.3，含0.3 mol/L的NaCl）替代抑制肽溶液和ACE溶液.

計(jì)算公式為：

式中：［HA］C為對(duì)照樣品的馬尿酸濃度；［HA］S為測(cè)定樣品的馬尿酸濃度；［HA］H為空白對(duì)照的馬尿酸濃度.

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

本研究設(shè)計(jì)了5組實(shí)驗(yàn)，每組只改變pH、水解溫度、水解時(shí)間、酶濃度（酶質(zhì)量/底物質(zhì)量）、底物濃度5種因素中的1種，探討其對(duì)堿性蛋白酶水解度的影響.

1.3.5 多因素實(shí)驗(yàn)

由于酶的最適水解溫度和最適pH值相對(duì)固定，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，遵循“均勻”和“整齊”的原則設(shè)計(jì)多因素實(shí)驗(yàn)，分析水解時(shí)間（2、3、4、5 h）、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、底物質(zhì)量濃度（40、45、50、55、60 g/L）3個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.多因素實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)我蛩貙?shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充說明.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶的水解度與其制備的凍干樣品ACE抑制肽的活性

本研究采用堿性蛋白酶水解豆粕，其水解度和產(chǎn)生的ACE抑制肽的活性隨取樣時(shí)間的變化規(guī)律如圖1所示.HHL和馬尿酸的檢測(cè)波長(zhǎng)與保留時(shí)間參考溫雪琴等［10］的方法.由圖1可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶的水解度在最初的1 h內(nèi)急劇升高，之后增速放緩.ACE抑制肽的抑制率在最初的1 h內(nèi)也是急劇升高，在水解2 h后達(dá)到峰值，抑制率超過55%.之后的2 h內(nèi)抑制率保持平穩(wěn)，水解4 h后抑制率開始下降.此結(jié)果與溫雪琴等［10］的研究存在差異，可能是由于水解條件中pH的改變引起的.

圖1 堿性蛋白酶水解度與其制備的凍干樣品ACE抑制肽的活性Fig.1 Hydrolysis degree and ACE inhibitory activity of alkali protease freeze dried samples

2.2 不同pH值對(duì)堿性蛋白酶水解度的影響

在底物質(zhì)量濃度為40 g/L、溫度為50℃、水解時(shí)間為4 h、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的條件下，分別測(cè)定pH 為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0時(shí)的水解度，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同pH值下堿性蛋白酶的水解度Fig.2 Hydrolysis degree of alkali protease under different pH

由圖2可以看出，pH為7.0、8.0、9.0時(shí)，堿性蛋白酶水解度的曲線在4 h內(nèi)的上升趨勢(shì)相似，但pH為7.0時(shí)的水解程度明顯高于pH為8.0和9.0時(shí)的水解程度.在pH為10.0和11.0的條件下，底物在最初的1 h內(nèi)就快速水解，水解度高達(dá)90%以上，在2 h以后水解度均達(dá)到了100%，這種情況可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水解過程中大量水解成氨基酸，肽的得率相對(duì)較低.盡管pH為7.0時(shí)堿性蛋白酶的水解度高于pH為8.0和9.0，但是水解度的高低與抑制率的高低并不完全一致，后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在pH7.0、8.0、9.0條件下制備的ACE抑制肽活性分別是90.56%、94.62%、94.65%.綜合以上結(jié)果，證實(shí)堿性蛋白酶水解豆粕生產(chǎn)ACE抑制肽的最佳pH為9.0.

2.3 不同溫度對(duì)堿性蛋白酶水解度的影響

在底物質(zhì)量濃度為40 g/L、pH為9.0、水解時(shí)間4 h、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的條件下，測(cè)定水解溫度分別為50、55、60、65、70℃條件下堿性蛋白酶的水解度，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同溫度下堿性蛋白酶的水解度Fig.3 Hydrolysis degree of alkali protease under different temperatures

由圖3可以看出，反應(yīng)體系中的溫度越高，水解度反而越低，這可能是由于高溫抑制了蛋白酶的活性.因此認(rèn)為堿性蛋白酶的最佳反應(yīng)溫度為50℃.

2.4 不同水解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解度的影響

在底物質(zhì)量濃度為40g/L、pH為9.0、溫度為50℃、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的條件下，分別測(cè)定水解1、2、3、4、5、6 h的水解度，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同時(shí)間下堿性蛋白酶的水解度Fig.4 Hydrolysis degree of alkali protease in different time

由圖4可以看出，堿性蛋白酶的水解度隨著反應(yīng)的進(jìn)行不斷增加，在最初的1 h內(nèi)增加速率很快，之后上升速率逐漸減慢，但是前期相關(guān)研究表明在3～4 h時(shí)該樣品的ACE抑制率高于6 h時(shí)的數(shù)值［10］.因此綜合考慮實(shí)驗(yàn)效率、水解度和抑制率之間的關(guān)系，判定堿性蛋白酶的最佳水解時(shí)間為4 h.

2.5 不同酶濃度對(duì)堿性蛋白酶水解度的影響

在底物質(zhì)量濃度為40g/L、pH為9.0、溫度為50℃、水解時(shí)間為4 h的條件下，分別測(cè)定酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)的水解度，結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出，堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%時(shí)豆粕的水解度最小，酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.0%～2.5%范圍內(nèi)，水解程度差別不大，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的水解度要略高于酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的水解度.綜合考慮水解產(chǎn)生的抑制肽的活性和酶的使用量，判定堿性蛋白酶的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%.

圖5 不同酶濃度下堿性蛋白酶的水解度Fig.5 Hydrolysis degree of alkali protease under different enzyme concentrations

2.6 不同底物濃度對(duì)堿性蛋白酶水解度的影響

本課題組前期已研究了底物質(zhì)量濃度為20、40、60 g/L條件下制備的ACE抑制肽的活性，發(fā)現(xiàn)底物濃度為20 g/L時(shí)抑制率最低，而40 g/L和60 g/L的抑制率差異不顯著，因此本研究在40～60 g/L之間設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，結(jié)合其他因素進(jìn)行進(jìn)一步探索，以尋求最適條件.在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、pH為9.0、溫度為50℃、水解時(shí)間4 h的條件下，分別測(cè)定底物質(zhì)量濃度為40、45、50、55、60 g/L時(shí)的水解度，結(jié)果如圖6所示.

圖6 不同底物濃度下堿性蛋白酶水解度的影響Fig.6 Hydrolysis degree of alkali protease under different substrate concentrations

由圖6可以看出，在水解的前2 h內(nèi)，底物質(zhì)量濃度為50 g/L的水解度明顯高于40 g/L的水解度，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，二者差別逐漸減弱，在4 h處近乎相等，均高于其他底物濃度的數(shù)值.據(jù)此判定堿性蛋白酶的最佳底物質(zhì)量濃度為40 g/L.

2.7 單因素實(shí)驗(yàn)所得樣品的ACE抑制活性

考察單一因素對(duì)堿性蛋白酶水解豆粕產(chǎn)生的ACE抑制肽活性的影響，計(jì)算各條件下的抑制率，結(jié)果如表1所示.

表1 堿性蛋白酶制備的凍干樣品抑制肽的ACE活性抑制率Tab.1 ACE inhibition rate of freeze dried samples made by alkali protease

由表1可以看出，本研究在pH為9.0、水解溫度為50℃、水解時(shí)間為4 h、堿性蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、底物質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，獲得的ACE抑制肽的活性最大，抑制率達(dá)到97.97%.因此判定此條件為最佳水解條件.

2.8 堿性蛋白酶最適水解條件的多因素實(shí)驗(yàn)

在蛋白酶的水解溫度和pH均為最適的條件下，考察水解時(shí)間、蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和底物濃度3個(gè)條件對(duì)堿性蛋白酶水解豆粕產(chǎn)生ACE抑制肽的影響，結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，在各組合實(shí)驗(yàn)中，水解時(shí)間為4 h、蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、底物質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，水解產(chǎn)生的ACE抑制肽的抑制率最大，為97.97%，這與單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同.

表2 多因素實(shí)驗(yàn)中制備ACE抑制肽血抑制率Tab.2 ACE inhibition rate in multivariate experiment

3 討論與結(jié)論

本研究以豆粕為底物，考察堿性蛋白酶在不同條件下的水解度和產(chǎn)生的ACE抑制肽的抑制率，并且尋求最優(yōu)的水解條件.單因素實(shí)驗(yàn)和多因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示，本實(shí)驗(yàn)確定的最適且穩(wěn)定的酶解工藝條件為：pH為9.0、水解溫度為50℃、水解時(shí)間為4 h、蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、底物質(zhì)量濃度為40 g/L.在此條件下，豆粕酶解產(chǎn)物ACE的抑制率可提高到97.97%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本課題組之前研究所得到的抑制率（64.21%）［10］.本研究還發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高pH（由8.0升至9.0）和延長(zhǎng)水解時(shí)間（由水解3 h升至4 h）的條件下，可使制備的ACE抑制肽活性得到大幅度提高.原因可能是pH的提高抑制了ACE分解因子［12］的活性，推遲了ACE抑制肽活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間；而且pH為9.0時(shí)堿性蛋白酶的活性更高，使ACE抑制肽大量生成，從而大大提高了酶解產(chǎn)物的抑制率.

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（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）

Optimization of hydrolysis conditions for the preparation of ACE inhibitory peptides by alkaline protease from soybean meal

TIAN Zhongyuan，WANG Yaping，LIU Shen，REN Yi，F(xiàn)ENG Xin，SUN Jianhua
（a.College of Life Sciences，b.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To get a highly efficient method for the production of angiotensin converting enzyme（ACE）inhibitory peptides，the soybean meal was hydrolyzed by alkaline protease under laboratory conditions.Meanwhile，a series of hydrolytic conditions were optimized by single factor method combined with multi-factors method.The results showed that the proper extension of hydrolytic time and increase of pH can greatly enhance the inhibitory activity of ACE inhibitory peptides.The comprehensive results of single factor method and multi-factors method showed the optimum hydrolysis condition was that：pH was 9.0，hydrolysis temperature was 50℃，hydrolysis time was four hours，enzyme mass fraction was 2.0%，substrate mass concentration was 40 g/L.Under this condition，the inhibition rate of ACE was up to 97.97%.

soybean meal；ACE inhibitory peptides；alkaline protease；hydrolytic condition；optimization

Q556

A

1671-1114（2016）03-0064-05

2015-11-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31272019）；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目（201103018）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣重點(diǎn)資助項(xiàng)目（201002180）.

田中原（1990—），男，碩士研究生.

馮 欣（1981—），女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事微生物應(yīng)用及發(fā)酵工程方面的研究.