曹志偉,孫忠晟,郭學金,王建琳,尹燕博

(1.青島農業(yè)大學動物科技學院,山東青島266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島266101)

雞I型IFN及TLR-3和TLR-7實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

曹志偉1,孫忠晟2,郭學金1,王建琳1,尹燕博1

(1.青島農業(yè)大學動物科技學院,山東青島266109;2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島266101)

為檢測雞抗病毒相關基因在病毒感染過程中的動態(tài)變化規(guī)律,研究建立了雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的實時熒光定量RT-PCR的檢測方法.根據GenBank提供的雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7參考序列設計了相應的特異引物,用常規(guī)RT-PCR方法從雞脾臟總RNA中擴增得到雞相應基因.將其cDNA分別克隆到pMD19-T載體中進行測序鑒定,采用SYBR Green I染料法,建立標準曲線并分析其溶解曲線.結果表明,這4種基因的檢測靈敏度可高達46 copies/μL,且具有良好的特異性和重復性.此檢測方法的建立為動態(tài)定量檢測及研究雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因的表達變化提供了有效的手段.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;實時熒光定量PCR

Corresponding authors:WANG Jian-lin;YIN Yan-bo

I型干擾素(Interferon,IFN)包括IFN-α和IFN-β,是機體抗病毒防御的重要組成,不僅可以通過細胞表面受體作用可使細胞產生抗病毒蛋白,同時還可增強NK細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力,被視為機體的免疫指示器[1-2].I型IFN的合成和表達是通過機體的模式識別受體的活化來完成的,其中TLR是關注較多的模式識別受體.雞的10個TLR中,和天然免疫相關的主要有TLR-3,TLR-7和TLR-15,而研究較多的為TLR-3和TLR-7[3],分別識別雙鏈RNA和單鏈RNA,二者被活化后可表達一些天然抗病毒因子,如I型IFN和促炎性細胞因子,發(fā)揮機體抗病毒天然免疫[4].

TLR-3和TLR-7可活化表達I型IFN等抗病毒因子,共同完成機體的抗病毒天然免疫反應,這是目前動物病毒性疾病研究的重要內容.故本研究擬建立一種用于檢測雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7分子mRNA的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法,為病毒感染后這些相關基因的定量檢測提供方法.

1　材料與方法

1.1主要儀器及材料TRIZol試劑、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶、pMD19-T,購自寶生物工程(大連)有限公司;Fast Start Universal SYBR Green Master,購自青島賽尚科貿有限公司;熒光PCR儀為杭州博日科技有限公司生產.

1.2引物的設計及合成根據GenBank上雞相關基因的序列及文獻設計各自的特異引物,由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(見表1).

1.3總RNA的提取及cDNA的合成使用TRIZol-氯仿-異丙醇法提取總RNA,按常規(guī)反轉錄體系進行反轉錄,反轉錄的cDNA-20℃保存.

1.4標準曲線的建立

1.4.1普通PCR擴增常規(guī)PCR反應體系進行PCR擴增.反應條件:94℃5 min;94℃30 s、55℃40 s、72℃90 s,30個循環(huán);72℃10 min;最后4℃結束反應.

1.4.2質粒標準品制備PCR產物電泳,試劑盒回收目的條帶,連入pMD19-T載體中,經PCR和測序鑒定的陽性重組質粒進行純度測定,并用紫外分光光度計測其260 nm OD值,計算其拷貝數(shù). 1.4.3建立定量標準曲線質粒倍比稀釋后進行SYBR Green I RT-PCR擴增.50 μL反應體系包括:SYBR Green Master(ROX)、上下游引物、模版.擴增參數(shù):50℃2 min;95℃10 min;95℃15 s、60℃60 s,40個循環(huán).經熒光定量RT-PCR檢測后,計算Ct值,取4～6個點繪制標準曲線.

1.5特異性用此方法檢測TNF-α、IL-1、新城疫病毒(NDV)、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)進行特異性驗證,同時設陰性和陽性對照.

1.6重復性試驗取3份不同的脾臟樣品,分別提取RNA進行實時熒光定量PCR.每份脾臟樣品分別作3次組內重復和組間重復性試驗,對檢測結果進行統(tǒng)計學分析.

1.7敏感性試驗用1X101～1X1010copies/μL之間不同拷貝數(shù)的陽性重組質粒分別做實時熒光定量PCR.

2　結果

2.1PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物凝膠電泳結果表明,擴增的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的大小與預期相符(見圖1).

圖1　IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7的PCR產物凝膠電泳圖

2.2重組質粒的篩選將重組質粒轉化入大腸桿菌DH5α內,進行藍白斑篩選,對經菌落PCR確認的陽性克隆菌進行擴大培養(yǎng),提取質粒DNA, PCR進一步確認陽性重組子.

2.3定量標準曲線的繪制

2.3.1陽性模版濃度IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7陽性質粒模版150倍稀釋后,用紫外分光光度計測其260 nm OD值分別為:0.148、0.173、0.203、0.195;質粒DNA濃度分別為:1 110、1 297.5、1 522.5、1 462.5 μg/μL;質?？截悵舛确謩e為:3.5X1011、4.1X1011、4.6X1011、4.5X1011copies/μL.

2.3.2標準曲線繪制對質粒10倍連續(xù)稀釋液進行實時熒光定量PCR檢測,采用樣點擬合法,得出各細胞因子的動力學擴增曲線和標準曲線方程(見圖2).

2.4線性關系、擴增效率確認根據上圖標準曲線可知,相關系數(shù)(R2)均大于0.98,結果可信度較高;標準曲線斜率均在-3～-3.5之間;PCR擴增效率(E)均在0.9～1.2之間,達到絕對定量實驗要求.

表2　重復性試驗結果

圖2　A、B、C、D分別為IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7動力學擴增曲線和標準曲線方程

2.5重復性試驗結果經計算,Ct值的變異系數(shù)(CV)值均在5%以內(見表2),表明該方法重復性良好.

2.6敏感性試驗檢測樣品在實時熒光定量PCR 40個循環(huán)內的Ct>0,則結果判為陽性.用建立的方法檢測10倍梯度稀釋的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因標準重組質粒,最小檢出模板濃度為101copies/μL.

2.7產物溶解曲線分析檢測樣品的溶解曲線均出現(xiàn)單峰,未見引物二聚體和其他非特異性擴增片段的曲線峰,且產物溶解溫度相同.

2.8特異性分析結果TNF-α、IL-1、NDV、H9N2 AIV均無特異性峰出現(xiàn),無引物二聚體及非特異性擴增產物出現(xiàn).

3　討論

研究認為,雞TLR-3可識別雙鏈RNA,然后快速誘導I型IFN的表達,且TLR-3與IFN-α和IFN-β在雞淋巴細胞和成纖維細胞系(DF-1)中以劑量依賴性的方式上調[5].TLR-7激動劑可誘導雞脾細胞中IFN-α和IFN-β的表達[6].SPF雞感染NDV、IBDV毒株后,TLR-3 mRNA和TLR-7 mRNA的表達水平明顯升高,且IFN-α和IFN-β的表達也明顯上調[7].這表明雞TLR-3、TLR-7和I型IFN的表達密切相關,是雞抗病毒天然免疫方面的重要指標.

PCR反應中的SYBR Green I熒光染料被激發(fā)出熒光信號,可用來積累實時監(jiān)測整個PCR反應進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[8-9].由于熒光閾值Ct與PCR體系中起始模板量的對數(shù)值之間有著嚴格的線性關系,故可用陽性梯度標準品的Ct制成標準曲線,再根據樣品的Ct,可以準確定量出目的基因起始模板的拷貝數(shù).由本實驗定量標準曲線可以看出,不同梯度IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7陽性克隆標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct之間有較好的線性相關關系.

本試驗過程中所構建的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7質粒測序結果表明,擴增結果為預期目的序列.實時熒光定量PCR熔解曲線只有一

個特異性單峰,TNF-α、IL-1、NDV、H9N2 AIV均無特異性峰出現(xiàn),且無引物二聚體及非特異性擴增產物出現(xiàn),說明擴增特異性很強.所建立的檢測方法中,4種細胞因子的CV值均在5%以內,表明這4種檢測方法重復性良好;用所建立的方法檢測10倍梯度稀釋的IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因標準重組質粒,最小檢出模板濃度為101copies/μL,表明這4種檢測方法的靈敏度高.故本研究方法克服了SYBR Green I熒光定量RT-PCR的易產生非特異信號和對引物設計要求高的特點.

綜上所述,本研究建立的方法,可以靈敏、特異、便捷地對雞IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7在mRNA水平進行定量檢測,該方法的建立對雞抗病毒天然免疫相關研究具有重要意義.

[1]Ottenhoff T H,Mutis T.Role of cytotoxic cells in the protective immunity against and immunopathology of intracellular infection [J].Eur J Clin Invest,1995,25(6):371-377.

[2]鄭玉姝,趙宏坤,崔治中.禽網狀內皮組織增生病病毒感染SPF雞對脾細胞中產生IFN-γ的影響[J].農業(yè)生物技術學報,2007,15(1):112-114.

[3]Shun Chen,Anchun Cheng,Mingshu Wang.Innate sensing of vi?ruses by pattern recognition receptors in birds[J].Vet Res,2013, 44(1):82-85.

[4]Kawai T,Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol,2010,44: 373-384.

[5]Karpala A J,Lowenthal J W,Bean A G.Activation of the TLR-3 pathway regulates IFN beta production in chickens[J].Dev Comp Immunol,2008,44:435-444.doi:10.1016/j.dci,2007.08.004.

[6]Stewart C R,Bagnaud-Baule A,Karpala A J,et al.Toll-like receptor 7 ligands inhibit influenza A infection in chickens[J].J Interferon Cytokine Res,2012,44:46-51.doi:10.1089/jir.2011.0036.

[7]Abdul-Careem M F,Haq K,Shanmuganathan S,et al.Induction of innate host responses in the lungs of chickens following infec?tion with a very virulent strain of Marek's disease virus[J].Virolo?gy,2009,44:250-257.doi:10.1016/j.virol.2009.08.001.

[8]孫忠晟,尹燕博,王平,等.SYBR GreenⅠ熒光定量PCR法檢測豬流感H3N2亞型病毒方法的建立[J].中國獸醫(yī)雜志, 2012,48(04):7-9.

[9]陳旭,齊鳳坤,康立功,等.實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用[J].東北農業(yè)大學學報,2010,41(08):148-155.

Development of real-time quantitative PCR for chicken IFN type I,TLR-3 and TLR-7

CAO Zhi-wei1,SUN Zhong-cheng2,GUO Xue-jin1,WANG Jian-lin1,YIN Yan-bo1
(1.College of Animal science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.Qingdao OLand-better Bioengineering Company,Qingdao 266101,China)

To study the dynam ic variety of chicken genes correlated with the innate immunity after infected with viruses,the real-time quantitative RT-PCR for IFN-α,IFN-β,TLR-3,and TLR-7 was developed in the study.Four pairs of primers were designed for these cytokines according to the gene sequences available in GenBank,and these four genes were amplified from total RNA from the in chicken sp leen.Then the cDNA of these four genes were cloned into the pMD19-T vector which are used as the standards after sequencing,and standard curve was established and melting curve was analyzed.The results showed that the meth?od with high detection sensitive,good specificity and repeatability.The results suggested that real-time quantitative RT-PCR de?veloped in the study will provide an efficient method for the quantitative analysis of chicken IFN-α,IFN-β,TLR-3,and TLR-7gene expression.

IFN-α;IFN-β;TLR-3;TLR-7;real-time quantitative RT-PCR

R 446.1

A

0529-6005(2016)02-0025-03

2014-07-02

國家自然科學基金項目(31272535);山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系家禽創(chuàng)新團隊建設項目(SDAIT-13-011-03);山東省自然科學基金(ZR2013CL022)

曹志偉(1989-),男,碩士生,從事預防獸醫(yī)學研究,E-mail:czwhehehe@163.com

王建琳,E-mail:bjsxxw@126.com;尹燕博,E-mail: yanboyin2011@163.com