高俊峰,王麗坤,李洪斌,崔宇超,侯美如

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所寄生蟲研究室,黑龍江齊齊哈爾161006)

異形同刺線蟲形態(tài)學(xué)鑒定及基于核糖體ITS序列分子進(jìn)化分析研究

高俊峰,王麗坤,李洪斌,崔宇超,侯美如

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所寄生蟲研究室,黑龍江齊齊哈爾161006)

對(duì)采自黑龍江省某鵝場(chǎng)萊茵鵝盲腸內(nèi)的線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,然后采取PCR方法擴(kuò)增蟲體核糖體ITS序列,進(jìn)行序列分析并以ITS序列為標(biāo)記基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,分析該線蟲與其他蟲體的進(jìn)化關(guān)系.結(jié)果表明,所分離的蟲體為異形同刺線蟲(Ganguleterakis dispar),該線蟲ITS序列全長為957 bp,其中ITS-1,5.8S和ITS-2大小分別為424 bp, 157 bp和376 bp.應(yīng)用BI,MP,NJ 3種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果相同,在尖尾目線蟲的分支中,本研究的5條異形同刺線蟲聚集在一起,與同科的雞異刺線蟲親緣關(guān)系較海綿異刺線蟲和Heterakis dahomensis接近.該結(jié)果為禽類異形同刺線蟲病的分子鑒別診斷方法提供了參考.

異形同刺線蟲;ITS序列;分子進(jìn)化分析

異形同刺線蟲隸屬于有尾感器亞綱(Secern?entia),尖尾目(Oxyurida),異刺科(Heterakidae),同刺屬(Ganguleterakis),是一種對(duì)禽類危害較大的寄生線蟲.該蟲寄生于鴨、鵝和野生禽類的盲腸內(nèi),造成盲腸組織機(jī)械性損傷、盲腸腫大、腸壁增厚形成結(jié)節(jié),引起盲腸炎和下痢.同時(shí)蟲體分泌的毒素和代謝產(chǎn)物使宿主中毒,嚴(yán)重者可造成死亡.

核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS,internal transcribed spacer region)序列被證實(shí)是良好的遺傳標(biāo)記[1],廣泛的應(yīng)用于寄生蟲領(lǐng)域.目前,關(guān)于異形同刺線蟲的研究和報(bào)道還較少,主要集中在流行病學(xué)調(diào)查方面,雖然黑龍江省曾有過鵝寄生異形同刺線蟲的報(bào)道,但并未對(duì)形態(tài)學(xué)進(jìn)行詳細(xì)的描述,另外,異形同刺線蟲分子領(lǐng)域的研究還未見報(bào)道.鑒于此,本試驗(yàn)以萊茵鵝體內(nèi)分離的異形同刺線蟲為研究對(duì)象,描述其主要形態(tài)學(xué)特征,并對(duì)其ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增,探討其分子進(jìn)化關(guān)系,為異形同刺線蟲的分子鑒定及鑒別診斷方法的構(gòu)建提供參考依據(jù).

1　材料與方法

1.1蟲體2014年6月,剖檢黑龍江省齊齊哈爾市周邊某鵝場(chǎng)病死成年萊茵鵝,于盲腸內(nèi)收集到大量新鮮蟲體,經(jīng)生理鹽水沖洗后,保存于70%乙醇中固定備用.

1.2主要試劑La Taq DNA聚合酶,dNTPs,DL-2 000 DNA Marker,pMD18-T載體,限制性內(nèi)切酶EcoR I,限制性內(nèi)切酶Hind III,均購自寶生物工程(大連)有限公司;Tissue DNA Kit,購自O(shè)MEGA bio-tek公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒,購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司.

1.3形態(tài)學(xué)鑒定將乙醇中固定的蟲體取出,置于載玻片上,加1滴甘油酒精使蟲體透明后,于顯微鏡下觀察,記錄數(shù)據(jù).

1.4總DNA的提取選取5條成蟲樣品,分別置于無菌離心管中,利用DNA提取試劑盒提取蟲體總DNA,提取的DNA樣品-20℃保存?zhèn)溆?

1.5ITS序列的擴(kuò)增及序列分析

采取GenBank登錄的通用引物NC2/NC5

上游引物NC5:5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

下游引物NC2:5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′.

PCR反映體系為25 μL;反應(yīng)條件為:92℃2 min;92℃30 s、50℃30 s、72℃1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn),形成單一清晰條帶.

按照膠回收試劑盒說明書將ITS序列純化回收后,連接于pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),篩選陽性重組菌,提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)過PCR鑒定和EcoR I,Hind III雙酶切鑒定后,陽性質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序.利用生物學(xué)軟件DNAStar,將擴(kuò)增的序列與相關(guān)線蟲ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析,確定ITS各段的大小.

1.6系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建以無尾感器亞綱的旋毛蟲(Trichinella spiralis)為外群,將本研究所獲得的異形同刺線蟲與尖尾目已知序列的相關(guān)線蟲的核糖體序列進(jìn)行比對(duì)分析(見表1).將上述線蟲核糖體ITS序列人工進(jìn)行整合,將ITS-1和ITS-2基因序列串聯(lián)進(jìn)行比對(duì),提交引導(dǎo)樹.使用MrBayes進(jìn)行貝葉斯推演構(gòu)建進(jìn)化樹.最大簡約法和最大似然法利用PAUP*4.0b 10軟件包,在默認(rèn)設(shè)置下進(jìn)行分析.繪制系統(tǒng)發(fā)生樹,探討異形同刺線蟲的系統(tǒng)發(fā)生位置.

表1　本研究構(gòu)建尖尾目線蟲系統(tǒng)發(fā)生樹選擇的線蟲及相關(guān)信息

2　結(jié)果

2.1蟲體的形態(tài)學(xué)鑒定此次從鵝體內(nèi)分離的蟲體呈乳白色,體表有橫紋,體前部有側(cè)翼膜,頭端鈍,具有3個(gè)唇片.口腔短,食道呈圓柱形,后端為發(fā)達(dá)的食道球和食道瓣,排泄孔位于食道中部.雄蟲長13.2～14.7 mm,尾末端尖細(xì),具有2根等長、形態(tài)相同的交合刺,無引帶.尾部有發(fā)達(dá)的尾翼膜,使蟲體末端向腹面彎曲,有13對(duì)肛乳突及1個(gè)圓形的泄殖孔前吸盤;雌蟲長15.2～ 18.3 mm,尾細(xì)長,末端彎向背面,生殖孔位于體中部稍后方,見中插彩版圖1.以上觀察結(jié)果與參考文獻(xiàn)[2]描述的一致,故鑒定為異形同刺線蟲. 2.2 ITS序列的擴(kuò)增與序列分析經(jīng)通用引物擴(kuò)增出的異形同刺線蟲ITS序列,產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),擴(kuò)增的條帶均出現(xiàn)在約1 000 bp位置,與預(yù)期目的片段一致(圖2),且無非特異性條帶.基因片段經(jīng)測(cè)序后人工校正,得到完整的ITS序列,全長為957 bp,其中ITS-1, 5.8S和ITS-2大小分別為424 bp,157 bp和376 bp.將獲得的ITS基因序列錄入GenBank,獲得基因登錄號(hào)為KM212953.

圖2　異形同刺線蟲核糖體ITS PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DL-2 000標(biāo)準(zhǔn)分子量;1～5:異形同刺線蟲樣品;6:陰性對(duì)照

2.3分子進(jìn)化分析構(gòu)建尖尾目線蟲系統(tǒng)發(fā)生樹,以旋毛蟲作為外群,參與構(gòu)群的線蟲除了本研究的異刺科的異形同刺線蟲外,還包括尖尾科的無刺屬、住腸屬、釘尾屬、管狀屬,異刺科的異刺屬和副盾皮屬.結(jié)果顯示,采用Bayes,MP和NJ 3種方法構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果基本一致.在尖尾目進(jìn)化樹中,本研究分離的五個(gè)異形同刺線蟲樣品處于聚集在一起,與雞異刺線蟲親源性最近,處于同一分支,海綿異刺線蟲和H.dahomensis親緣性最近,處于同一分支.有鉤副盾皮線蟲與其他異刺科線蟲具有較高的親源性,較尖尾科線蟲親源關(guān)系近(圖3).

圖3　MP,BI和NJ 3種方法構(gòu)建的異形同刺線蟲系統(tǒng)發(fā)生樹

3　討論

異形同刺線蟲病呈世界性分布,多地曾報(bào)道[3-5],在黑龍江省,除1981年區(qū)域調(diào)查時(shí)在鴨鵝和王春仁(2004)報(bào)道過鴻雁感染過外[6],再未見禽類發(fā)生該病的報(bào)道,作者分析不是該蟲感染少,而是一直被誤認(rèn)為是雞異刺線蟲.盡管雞異刺線蟲和異形同刺線蟲成蟲形態(tài)學(xué)非常相似,但是可以通過雄蟲交合刺的形狀來鑒別.異刺線蟲雄蟲右側(cè)交合刺較左側(cè)長,而異形同刺線蟲具有兩根等長的交合刺.本試驗(yàn)分離的線蟲根據(jù)寄生部位、蟲體大小及形態(tài)特點(diǎn)與之前文獻(xiàn)描述[2]的異形同刺線蟲一致,故鑒定為異形同刺線蟲.

核糖體DNA(rDNA)序列因其功能上的高度保守性和進(jìn)化的時(shí)鐘性,已被廣泛地應(yīng)用于物種分類和遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究,尤其是物種的種間分類研究[7].唐穎[8]等對(duì)東北地區(qū)不同地理位置采集的華支睪吸蟲ITS1序列多態(tài)性研究,結(jié)果證實(shí)ITS1序列可以區(qū)分種間遺傳關(guān)系.嚴(yán)若峰等[9]對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲不同藥物耐藥性蟲株,不同地理位置和不同宿主來源的蟲株ITS序列進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS序列在種內(nèi)相對(duì)保守,不同蟲株間變異較小.閆文朝等[10]對(duì)兔斯氏艾美耳球蟲ITS序列進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)斯氏艾美耳球蟲蟲株種內(nèi)變異率較高,且與雞球蟲和嚙齒類動(dòng)物球蟲同源性較低.大量研究表明,ITS序列是寄生蟲蟲種鑒定和分子診斷方法中具有重要應(yīng)用價(jià)值的基因區(qū)段.因此,本試驗(yàn)是首次對(duì)異形同刺線蟲核糖體ITS序列進(jìn)行研究報(bào)道,通過對(duì)ITS序列的比對(duì)分析,探討異形同刺線蟲的種間差異情況和在尖尾目中的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系.

尖尾目線蟲中,P.ambiguus的ITS1(292)和ITS2(306)長度均為目前已知最小,而A.tetraptera的ITS1(662)和ITS2(598)長度均為目前已知最大(見表1).本研究擴(kuò)增的5條異形同刺線蟲樣品ITS序列,經(jīng)過生物學(xué)軟件分析,ITS序列長度為957 bp,其中ITS-1和ITS-2大小分別為424 bp和376 bp,均在尖尾目線蟲長度范圍內(nèi),與先前的研究相一致.本試驗(yàn)5個(gè)樣品的ITS序列幾乎完全一致,僅在樣品1中ITS-2的第202位點(diǎn)A突變成C;在樣品2中ITS-2的第297位點(diǎn)T突變成C,其余序列均一致.

通過對(duì)本試驗(yàn)擴(kuò)增的異形同刺線蟲ITS序列進(jìn)行分析,與尖尾目線蟲同源性分析,與異刺科線蟲同源性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于尖尾科線蟲,在異刺科內(nèi)的種間差異為24.2%～52.7%.ITS1和ITS2序列G+C含量分別為44.0%和42.8%,除較P.uninata(49.0%和44.6%)、P.ambiguus(52.4%和57.5%)和S.muris (47.0%和46.8%)的ITS1和ITS2序列G+C含量低,比其他尖尾目線蟲ITS1和ITS2序列G+C含量高.

利用Bayes,MP和NJ構(gòu)建的尖尾目線蟲系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果表明,本試驗(yàn)中的異形同刺線蟲樣品與雞異刺線蟲親緣性最近,處于同一分支,海綿異刺線蟲和H.dahomensis親緣性最近,處于同一分支.有鉤副盾皮線蟲與其他異刺科線蟲具有較高的親源性,較尖尾科線蟲親源關(guān)系近,該結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致,本試驗(yàn)結(jié)果表明,ITS片段可作為遺傳標(biāo)記用以鑒定異刺科線蟲種間遺傳關(guān)系,是良好的遺傳標(biāo)記,本試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)異形同刺線蟲進(jìn)一步的分類、鑒定、遺傳變異研究、防治等具有重要意義.

[1]牛慶麗,羅建勛,殷宏.轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)在寄生蟲分子生物學(xué)分類中的應(yīng)用及其進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病,2008,16 (4):41-47.

[2]趙輝元.家畜寄生蟲與防制學(xué)[M].長春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1996.

[3]Zhao C,Onuma M,Asakawa M,et al.Preliminary studies on de? veloping a nested PCR assay for molecular diagnosis and identifi?cation of nematode(Heterakis isolonche)and trematode(Glaphy?rostomum sp)in Okinawa rail(Gallirallus okinawae)[J].Vet Para?sitol,2009,163(1-2):156-160.

[4]Callinan R B.Nodular typhlitis in pheasants caused by Heterakis isolonche[J].Aust Vet J,1987,64(2):58-59.

[5]Frank C.First detection of Heterakis isolonche in Burgenland[J]. Angew Parasitol,1977,18(3):162-163.

[6]王春仁,鄒希明,翟寶庫,等.黑龍江省鴻雁體內(nèi)檢出異形同刺線蟲[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2004(01):38-39.

[7]林睿,黎學(xué)銘.吸蟲種株基因差異的研究進(jìn)展[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué),2002,8(5):310-313.

[8]唐穎,路義鑫,韓彩霞,等.東北地區(qū)華支睪吸蟲ITS1基因序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33(5):405-407.

[9]嚴(yán)若峰,宋小凱,徐立新,等.基于ITS序列的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(7):1117-1122.

[10]閆文朝,韓利方,張龍現(xiàn),等.斯氏艾美耳球蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列的克隆及PCR檢測(cè)方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(6):1003-1008.

M orphological identification and molecular phylogenetic analyses based on ITS sequences of Ganguleterakis dispar

GAO Jun-feng,WANG Li-kun,LI Hong-bin,CUI Yu-chao,HOU Mei-ru
(Department of Parasitology,Heilongjiang Institute of Veterinary Science,Qiqihar 161006,China)

Morphological identification methods were used to identify the species of the nematode,which were isolated from goose(Rhine geese)intestinal collected from Heilongjiang.Then the ITS sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR)and compared with other nematodes available in GenBankTMby biology software,and phylogenetic relationships betweep them were reconstructed.The result showed that the length of ITS sequence was 957 bp and ITS-1,5.8S and ITS-2 sequences of G.dispar were 424 bp,157 bp and 376 bp in length,respectively.Topologies of all trees inferred by three different methods(BI, MP,and NJ)with different building strategies and/or different distance models were identical.Five samples of G.dispar in the study were clustered together.The result provides a reference for molecular identification diagnostic method of this disease.

Ganguleterakis dispar;ITS sequences;Phylogenetic analyses

HOU Mei-ru

S852.73+1

A

0529-6005(2016)02-0018-03

2014-11-18

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2014C033)

高俊峰(1985-),男,碩士,主要從事分子寄生蟲學(xué)與動(dòng)物寄生蟲病防治的研究,E-mail:13766785033@163.com

侯美如,E-mail:houmeiru168@126.com