劉恒全，潘長江，張文凱，劉　濤

（1.深圳邁德科技有限公司，廣東深圳　518103；2.淮陰工學(xué)院江蘇省介入醫(yī)療器械重點實驗室，江蘇淮安　223003）

·基礎(chǔ)與實驗研究·

不同藥物含量血管支架對內(nèi)皮化進(jìn)程的影響

劉恒全1*，潘長江2，張文凱1，劉濤2

（1.深圳邁德科技有限公司，廣東深圳518103；2.淮陰工學(xué)院江蘇省介入醫(yī)療器械重點實驗室，江蘇淮安223003）

目的探討不同劑量的藥物支架在抑制血管再狹窄過程中對內(nèi)皮化進(jìn)程的影響。方法采用超聲霧化法在L605金屬支架表面制備不同雷帕霉素含量的藥物支架，將其分別植入新西蘭大白兔腹主動脈，第1、4、12周后通過掃描電鏡、組織切片分析藥物含量對血管支架內(nèi)皮化程度的影響。結(jié)果不同藥物含量的血管支架在各時間點血管內(nèi)腔通暢、光滑、無血栓形成，但隨著藥物含量的升高，內(nèi)皮化程度會延遲。結(jié)論雷帕霉素含量80～110 μg/cm時藥物支架對血管功能恢復(fù)及防止再狹窄作用顯著。

支架；冠狀動脈再狹窄；藥物含量；內(nèi)皮化

血管支架植入術(shù)是治療冠狀動脈狹窄的有效方法。與球囊簡單擴張和金屬裸支架相比，藥物洗脫血管支架（drug eluting stent，DES）的臨床應(yīng)用使得血管內(nèi)再狹窄率下降到10%以內(nèi)，有效降低了介入治療中支架內(nèi)再狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生［1-2］。然而，DES表面涂層所裝載的藥物（一般為雷帕霉素、紫杉醇等）在抑制平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells，SMCs）增殖的同時，也阻礙了具有天然抗凝和保護(hù)血管功能的內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）層愈合，導(dǎo)致靶病變血管血運重建（target lesion revascularization，TLR）中血管支架在病變血管部位晚期貼壁不完全或內(nèi)皮化延遲，最終導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄和晚期血栓形成等不良事件的發(fā)生［3-5］。本研究在支架表面調(diào)控載藥量，旨在減少藥物支架在抑制血管再狹窄過程中對內(nèi)皮化進(jìn)程的影響。

1　材料與方法

1.1一般資料藥物載體選用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），其聚乳酸（PL）與羥基乙酸（GA）混合比例為4∶1，定量時精確到0.001 mg。實驗動物為新西蘭大白兔42只，由廣東省實驗動物中心提供，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雄雌隨機。

1.2儀器與方法

1.2.1藥物支架的制作采用超聲霧化法在L605支架表面制備雷帕霉素藥物涂層，根據(jù)噴涂圈數(shù)來設(shè)計涂層重量，根據(jù)藥物含量不同分為A（不含雷帕霉素）、B（雷帕霉素80 μg/cm）、C（雷帕霉素110 μg/ cm）、D組（雷帕霉素170 μg/cm），每組植入9只實驗動物，余6只備用。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）確認(rèn)藥物含量及藥物比率，HPLC測量濃度60 μg/ml，洗脫液體積4 ml，保留時間為14 min。藥物比率計算方法：藥物比率=藥物含量/（藥物支架重量-支架噴涂前重量）×100%。

1.2.2動物實驗采用巴比妥類麻醉劑對36只實驗兔全麻后切開后腿皮膚，鈍性分離兔右股動脈，結(jié)扎股動脈遠(yuǎn)端；股動脈切開小口，逆行置入導(dǎo)絲（0.014× 190 cm）至腹主動脈，在導(dǎo)絲引導(dǎo)下植入藥物支架；通過壓力泵向球囊內(nèi)注入肝素/生理鹽水，維持壓力16 atm不少于5 s，將支架釋放并固定腹主動脈的位置，撤出球囊導(dǎo)管；術(shù)后逐層縫合皮下組織及皮膚，消毒傷口周圍皮膚后肌肉注射青霉素20萬U，保溫至動物蘇醒后歸籠飼養(yǎng)。

在支架植入后在第1、4、12周分別以空氣栓塞法處死實驗兔，每次3只，分離腹主動脈并剪取含支架部分血管。以生理鹽水沖洗血管內(nèi)外壁，在血管支架1/ 2處剪下帶支架一段血管，再沿縱軸剪斷支架并小心展開支架與血管壁，以戊二醛溶液固定。將已固定的血管段分別置于 60%、70%、80%、90%、100%乙醇中各脫水1 h；之后分別浸入98%乙醇與99%丙酮比為40∶60、20∶80的溶液中換液0.5 h；最后浸入99%丙酮換液1 h?？焖俑稍锖笥脪呙桦婄R觀察。

將剩下血管段直接浸入4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h；之后予以脫水、透明、樹脂包埋，切片厚度約為100 μm，然后再用磨拋機磨薄至50 μm，HE染色后用光學(xué)顯微鏡拍片，根據(jù)形態(tài)學(xué)分析內(nèi)膜增生情況。

2　結(jié)果

圖1示雷帕霉素藥物含量為110.00 μg/cm時HPLC到達(dá)吸收峰的時間約為14 min。通過支架噴涂前、后的重量差值計算得藥物涂層重量約為277.20 μg/cm，對雷帕霉素特征峰面積進(jìn)行積分處理，該涂層中雷帕霉素藥物含量為109.50 μg/cm，藥物比率為39.50%。

血管支架表面藥物涂層分布均一、連續(xù)，顏色均勻（圖2）。所有支架均順利植入且實驗動物均存活至終點，將靶血管取出后均未發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)血栓。第1周4組支架均有新生組織不連續(xù)情況出現(xiàn)，但支架表面細(xì)胞及組織物差別不顯著；A、D組支架表面組織物覆蓋較B、C組更薄，即B、C組支架表面組織覆蓋較完全。支架植入后第4周與第12周所有血管段組織均完全被組織物覆蓋，各組差異性不大，但第4周時，C組比A、B、D組的組織覆蓋程度高（圖3）。各血管支架的硬組織切片示D組支架比其他組支架的血管段壁厚。支架植入后第1周時，各組支架植入后血管內(nèi)膜增生均不明顯，第4周時A、D組支架表面有少量組織物覆蓋，C組支架表面已完全被連續(xù)組織覆蓋；支架植入后第12周，所有支架表面均被連續(xù)內(nèi)膜組織覆蓋，無內(nèi)膜增生。支架植入時間愈長D組的內(nèi)壁厚度較其他組增厚越明顯（圖4）。

圖1　藥物支架雷帕霉素特征吸收峰

圖2　藥物涂層支架的表面形貌

3　討論

本研究中藥物聚合物載體PLGA屬于脂肪族聚酯，分子長鏈的每個單體單元中均含有酯鍵，鏈以羧基和羥基為端基［6］。由于血管壁表面的內(nèi)皮層不僅具有調(diào)節(jié)血壓以及凝血與抗凝平衡等特殊功能，而且健康完整的內(nèi)皮層還是阻止粥樣硬化斑塊和血栓形成的天然屏障［7］。在內(nèi)皮細(xì)胞完全覆蓋血管支架前，抗增生藥物可直接作用于局部血管壁，因此選擇適量的藥物可起到抑制平滑肌細(xì)胞的過度增殖、遷移，從而預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的作用［8-9］。一般情況下，血管支架表面藥物含量通過體外釋放來評估其釋放速率及安全性，尚缺少在體實驗來評價藥物含量對內(nèi)皮化進(jìn)程影響的直接證據(jù)，尤其是不同植入周期藥物釋放量對血管組織的影響。若血管組織局部藥物劑量過高，容易產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、血管愈合延遲，影響血管正常重塑過程［10-11］。

圖3　不同周期血管支架表面形貌　A～C.分別為A組支架植入后第1、4、12周；D～F.分別為B組支架植入后第1、4、12周；G～I(xiàn).分別為C組支架植入后第1、4、12周；J～L.分別為D組支架植入后第1、4、12周

與裸支架比較，藥物洗脫支架植入后血管內(nèi)皮化延遲，其機制可能與聚合物的生物相容性，藥物的劑量、特性與分布有關(guān)。當(dāng)局部藥物濃度過高會抑制內(nèi)皮層的修復(fù)［12-13］。本研究結(jié)果表明，支架植入后第1、4、12周不同雷帕霉素含量的藥物洗脫支架（包括只含有PLGA涂層的支架）均無血栓形成。支架植入后第1周，只含PLGA涂層和170 μg/cm雷帊霉素藥物的支架，較80 μg/cm與110 μg/cm雷帊霉素的藥物支架內(nèi)皮化覆蓋程度有一定差異，因此無論藥物支架還是普通支架，新生內(nèi)膜的細(xì)胞成分和內(nèi)皮化過程相似，雷帕霉素在抑制平滑肌細(xì)胞的同時，對內(nèi)皮細(xì)胞也有一定的影響，特別是藥物濃度較高時影響更顯著。雷帕霉素藥物支架植入后第12周時無內(nèi)膜增生，無支架內(nèi)血栓形成，表明其有減少內(nèi)膜增生與降低支架內(nèi)再狹窄的作用。

圖4　不同周期血管支架的組織切片（HE，×100） A～C.分別為A組支架植入后第1、4、12周；D～F.分別為B組支架植入后第1、4、12周；G～I(xiàn).分別為C組支架植入后第1、4、12周；J～L.分別為D組支架植入后第1、4、12周

綜上所述，雷帕霉素含量為80～110 μg/cm的藥物支架能較早內(nèi)皮化，對血管功能恢復(fù)以及防止血栓形成作用明顯。

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Effect of various drug-content coated stents during endothelialization in vivo

LIU Hengquan1*，PAN Changjiang2，ZHANG Wenkai1，LIU Tao2
（1.Shenzhen Medtech Co.Ltd.，Shenzhen 518103，China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory for Interventional Medical Devices，Huaiyin Institute of Technology，Huai'an 223003，China）

ObjectiveTo explore the effect of various drug-content coated stents during endothelialization in vivo.Methods The various contents of Rapamycin coated L605 stents were prepared by ultrasonic nebulization method，and the stents were implanted into abdominal aorta of New Zealand rabbits.The effect at 1st，4th，12thweeks of various drug-content stents on endothelialization process was investigated by scanning electron microscopy and tissue section.ResultsIntravascular lumen was smooth，and no any thrombosis was observed to all stents in each period，but the endothelialization was delayed while the drug concentrate rose.ConclusionIt is satisfactory drug concentrate of 80-110 μg/cm to vessel remodeling and prevent restenosis.

Stents；Coronary restenosis；Drug content；Endothelialization

R543.3；R452

A

1672-8475（2016）08-0490-05

10.13929/j.1672-8475.2016.08.010

國家自然科學(xué)基金（31470926）、深圳市科創(chuàng)委專項基金（CXZZ20140401143609670）。

劉恒全（1977—），男，四川資陽人，博士，高級工程師。研究方向：心血管植入器械的研究和開發(fā)。

劉恒全，深圳邁德科技有限公司，518103。

E-mail：liuhengquan@aliyun.com

2016-04-11

2016-06-30