劉小花, 崔　方, 張夢(mèng)婷, 王　影, 封士蘭

(蘭州大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州　730000)

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HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芪中的5種黃酮類成分的含量
——一種新的應(yīng)用于藥學(xué)實(shí)驗(yàn)分析方法

劉小花, 崔方, 張夢(mèng)婷, 王影, 封士蘭

(蘭州大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州730000)

高效液相色譜技術(shù)是藥學(xué)院本科生儀器分析的必修內(nèi)容。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芪中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮和芒柄花素的含量,該方法操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,不僅用于黃芪藥材中黃酮類成分的含量測(cè)定,也可用于藥學(xué)院分析化學(xué)、制劑分析等學(xué)生實(shí)驗(yàn),讓學(xué)生掌握高效液相色譜技術(shù)。

藥物檢測(cè)； 黃芪； 黃酮類成分； HPLC

高效液相色譜法(high performance liquid Chromatography, HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。2010版中國(guó)藥典中80%以上的中藥材和制劑其含量測(cè)定項(xiàng)均采用高效液相色譜法,高效液相色譜技術(shù)是藥學(xué)院本科生及研究生儀器分析的必修內(nèi)容,也是制劑分析、藥物分析和現(xiàn)代色譜分析的常規(guī)方法,因此掌握高效液相色譜技術(shù)對(duì)于藥學(xué)類技術(shù)人才是必要的。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch. )Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根, 具有補(bǔ)氣固表、 利尿托毒、排膿、 斂瘡生肌等功效[1]。其主要化學(xué)成分包括黃酮類化合物、黃芪多糖以及黃芪皂苷等。黃芪主產(chǎn)于我國(guó)甘肅、內(nèi)蒙和山西三省,不同地區(qū)的黃芪質(zhì)量有一定的差別[2]。

房樹標(biāo)等[3]利用紫外分光光度法測(cè)定了黃芪藥材中總黃酮的含量,但是此法對(duì)于黃芪藥材中的多種黃酮類成分無法進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。石子儀等[4-5]采用HPLC-DAD法建立芒柄花素以及毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類成分的含量測(cè)定方法。趙強(qiáng)強(qiáng)等[6-11]采用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷等皂苷類成分的含量。2010版中國(guó)藥典已將黃芪甲苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷作為指標(biāo)成分控制黃芪藥材及其制劑的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)首次在黃芪藥材中鑒別出金雀異黃酮,并建立同時(shí)測(cè)定包括金雀異黃酮在內(nèi)的5個(gè)黃酮類成分含量的方法。本實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行了天然藥物化學(xué)本科生綜合實(shí)驗(yàn)和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)改革[12-13],取得不錯(cuò)成績(jī)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀系列:Millennum32 在線工作站,在線脫氣機(jī),四元泵,2771自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,2998二極管陣列檢測(cè)器；SpursilTMC18 柱(250 mm×4.6 mm, 5μm,北京迪馬有限公司)；乙腈為色譜純(美國(guó)邁瑞達(dá)科技有限公司)；甲醇為色譜純(美國(guó)邁瑞達(dá)科技有限公司)；水為超純水；95%乙醇為分析純；電熱恒溫水浴鍋；KQ3200DB 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

對(duì)照品毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀異黃酮均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

黃芪藥材(7批),自采或購(gòu)買,具體產(chǎn)地見表1,經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥研究所馬志剛教授鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

表1　黃芪藥材來源與品種

1.2色譜條件

SpursilTMC18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)和水(B),其梯度洗脫條件見表2；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為210～400 nm；2998二極管陣列檢測(cè)器；進(jìn)樣量為10 μL。

表2　梯度洗脫條件

1.3對(duì)照品溶液配制

分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 g/L的對(duì)照品溶液,置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.4樣品處理

稱取黃芪藥材2 g,以10倍量(20 mL)的95% 乙醇回流提取,每次1 h,共提取3次,過濾并合并提取液,將合并液置水浴鍋上蒸餾濃縮至近干;干樣品用95% 乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,定容至刻度,搖勻,即得藥材的乙醇提取液(供試品溶液)。微孔濾膜(0.45 μm)濾過后以封口膠封存,置4 ℃冰箱冷藏備用。7批藥材均按上述過程處理。

2　方法學(xué)考察

2.1線性關(guān)系考察

分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液并用甲醇逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度對(duì)照品溶液,進(jìn)樣5 μL進(jìn)行測(cè)定,梯度洗脫條件見表2。5種黃酮類化合物以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見表3。各回歸方程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3　對(duì)照品的回歸方程

注:表中F1—F5分別為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素。

2.2穩(wěn)定性考察

同一樣品分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,F1—F5對(duì)照品的RSD(%)分別為1.82%、0.76%、1.75%、1.60%、1.96%,所有的RSD<2%,符合規(guī)定。

2.3精密度考察

取對(duì)照品溶液測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度。同一對(duì)照品溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣5μL,計(jì)算日內(nèi)精密度。同一對(duì)照品溶液連續(xù)3 d每天進(jìn)樣2次,計(jì)算日間精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5個(gè)黃酮類化合物的日內(nèi)和日間精密度的RSD<2%,符合規(guī)定。

2.4重復(fù)性考察

取1號(hào)黃芪藥材(來源于華亭馬峽)6份,每份2 g,精密稱定,制備成供試品溶液,按照樣品測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)得F1—F5的5個(gè)黃酮類化合物的平均含量和RSD。測(cè)定結(jié)果表明,5種化合物的RSD<2%,重復(fù)性符合規(guī)定。

2.5準(zhǔn)確度考察

以加樣回收率考察準(zhǔn)確度。取同一批已知含量的1號(hào)(華亭馬峽)黃芪藥材5份,每份2 g,精密稱定,各加入適量的各種對(duì)照品溶液(F1—F5質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 g/L)按照上述的對(duì)照品溶液制備中的操作測(cè)定,計(jì)算5個(gè)成分的加樣回收率,結(jié)果表明,5個(gè)黃酮類成分的平均回收率都在96.86%～101.09%,RSD<2%,符合規(guī)定。

2.6樣品測(cè)定

取7批黃芪藥材,制備成樣品溶液,精密吸取10 μL進(jìn)入HPLC儀進(jìn)行分析,測(cè)得的色譜圖見圖1,與標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)比見圖2,毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的保留時(shí)間tR和含量測(cè)定結(jié)果見表4。

圖1　7批黃芪藥材提取物HPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

圖2　藥材與5個(gè)黃酮類成分HPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

分析物tR/min5種黃酮類成分的含量/(μg·g-1)樣1樣2樣3樣4樣5樣6樣7F16.4684.14350.09126.10213.62411.42222.09295.54F213.1432.71115.82104.10106.98189.56136.9957.82F316.6654.23256.077.7315.6629.8826.53168.52F421.011.011.360.871.431.751.821.03F526.7415.40120.861.49018.8523.0683.99

由圖1和圖2可知,黃芪藥材提取物的HPLC-DAD指紋圖譜中有5個(gè)共有峰,通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),F1—F5號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物分別為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1提取方法評(píng)價(jià)

采用95%乙醇作為溶劑,對(duì)7批來自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進(jìn)行回流提取, 5個(gè)黃酮類成分在該提取條件下得到的峰面積較大,提取效果良好,操作簡(jiǎn)單。

3.2檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)價(jià)

采用HPLC-DAD法對(duì)7批來自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進(jìn)行黃酮類成分的含量測(cè)定,測(cè)得各對(duì)照品——毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的最大吸收波長(zhǎng)分別為258.1、249.8、248.7、259.3、248.7 nm。本實(shí)驗(yàn)選取254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),對(duì)這5個(gè)黃酮類成分進(jìn)行測(cè)定,其結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好。說明將HPLC-DAD法應(yīng)用于黃芪藥材中黃酮類成分的質(zhì)量控制中效果好。

3.3含量測(cè)定分析

測(cè)定顯示黃芪藥材內(nèi)的5種黃酮類成分含量大小關(guān)系為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量>毛蕊異黃酮含量>芒柄花苷含量>芒柄花素含量> 金雀異黃酮含量。其中,7批藥材中的金雀異黃酮含量均少于2 μg/g,而以往的學(xué)者做黃芪藥材中成分測(cè)定時(shí),選用的對(duì)照品在藥材中的含量往往比較高,因此金雀異黃酮的峰形不易被發(fā)現(xiàn)。

此外,從表4中可發(fā)現(xiàn),即使是同一化合物在7批不同的黃芪藥材中的含量有較大的差異,這可能與黃芪的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年限以及儲(chǔ)藏時(shí)間等因素有關(guān)。

2010版藥典將黃芪甲苷以及毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量作為黃芪藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究在黃芪藥材中同時(shí)測(cè)定了金雀異黃酮等5個(gè)黃酮類成分的含量,為多指標(biāo)控制黃芪藥材的質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4　結(jié)語(yǔ)

高效液相色譜法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù),也是藥物檢測(cè)必備的現(xiàn)代分析技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)方法的建立充分利用現(xiàn)代技術(shù)手段,使學(xué)生了解和應(yīng)用當(dāng)前新技術(shù),牢固掌握所學(xué)的理論知識(shí),實(shí)現(xiàn)了藥學(xué)院本科生及研究生的儀器分析、制劑分析、藥物分析和現(xiàn)代色譜分析等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的改進(jìn),為培養(yǎng)高素質(zhì)的掌握現(xiàn)代分析手段的藥學(xué)類技術(shù)人才創(chuàng)造了條件。

References)

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A new analysis method for pharmaceutical student experiment by HPLC to simultaneously determine five flavonoids’ compounds in RadixAstragali

Liu Xiaohua, Cui Fang, Zhang Mengting, Wang Ying, Feng Shilan

(School of Pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

High performance liquid chromatography (HPLC) technique is the compulsory courses of instrument analysis to undergraduates. The content determinations of more than 80% of Chinese herbs and preparations in the Chinese pharmacopoeia 2010 are using HPLC, so it is necessary to master the HPLC technique for training the pharmaceutical talents. The analysis of experimental method is established to simultaneous determination of five flavonoids’ compounds in RadixAstragaliby HPLC, and the method is simple and reproducible. It can be used as principles of quantitative analysis to flavonoids compounds of RadixAstragali, also as student analytical experiments of chemistry and preparation analysis in order to improve students grasping the technology of HPLC.

pharmaceutical determination; RadixAstragali; flavonoids; HPLC

10.16791/j.cnki.sjg.2016.02.008

實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法

2015- 07- 08修改日期：2015- 08- 27

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目( lzujbky-2015-59)

劉小花(1976—),女,甘肅蘭州,博士,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,蘭州大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心副主任,研究方向?yàn)樗幬锓治?

E-mail:liuxiaoh@lzu.edu.cn

R284.1

B

1002-4956(2016)2- 0024- 04