何驍，鄧?yán)蚶?，鄒康（.郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院骨科一區(qū)，湖南43000；.郴州市第一人民醫(yī)院北院/兒童醫(yī)院兒科，湖南43000）

菲立磁標(biāo)記兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞自體移植坐骨神經(jīng)的研究

何驍1，鄧?yán)蚶?，鄒康1
（1.郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院骨科一區(qū)，湖南423000；2.郴州市第一人民醫(yī)院北院/兒童醫(yī)院兒科，湖南423000）

目的在合適示蹤劑幫助下，采用無創(chuàng)傷性影像學(xué)技術(shù)來在體識(shí)別、跟蹤移植后骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）的存活狀態(tài)及與宿主神經(jīng)組織整合情況，了解BMSCs移植周圍神經(jīng)后細(xì)胞如何遷移、如何凋亡和如何被吸收。方法BMSCs原代分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)，菲立磁標(biāo)記、鑒定及傳代后注入坐骨神經(jīng)損傷的兔模型中，并于細(xì)胞移植后第1、2、4、8、16周分別行磁共振成像（MRI）、透射電鏡及免疫組織化學(xué)等。結(jié)果將菲立磁標(biāo)記的干細(xì)胞移植后，采用MRI技術(shù)對(duì)兔坐骨神經(jīng)進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)，以T1加權(quán)像（T1WI）和T2加權(quán)像（T2WI）序列檢查可見移植菲立磁-多聚賴氨酸（FE-PLL）標(biāo)記干細(xì)胞的坐骨神經(jīng)區(qū)有明顯低信號(hào)改變，T2WI掃描序列信號(hào)較T1WI明顯。結(jié)論兔BMSCs源神經(jīng)干細(xì)胞移植后，可在坐骨神經(jīng)內(nèi)存活、遷移、分化，T2WI序列成像可清晰顯示菲立磁標(biāo)記的BMSCs所致的低密度影像改變。利用MRI可以對(duì)移植后的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行初步活體追蹤。

移植，自體；坐骨神經(jīng)；磁共振成像；菲立磁；骨髓基質(zhì)細(xì)胞

【Abstract】Objective To adopt the non-invasive imaging technology in the help of suitable tracermaterial to in vivo recognize and track the survivalstatus of post-trans plantbone marrow stromal cells（BMSCs）and integration condition of hostnervous tissue，to understand themigration，apoptosis and absorption of cells after bonemarrow stromal cells autotransplant into peripheral nerve.M ethods BMSCs were primarily isolated，cultured，induced，F(xiàn)eridex labeled，identified and injected into the rabbitmodelof sciatic nerve injury after passage.Then MRI，transmission electron microscope and immunohis tochemicalex aminations were performed at1，2，4，8 and 16 weeks after cell transplantation.Results After Feridex labeled stem cell trans plantation，MRI scanning on rabbitsciatic nerve found that the obvious low signal change in the sciatic nerve area of FE-PLL labeled stem cells could be seen by the T1W1 and T2W1 sequence examinations，moreover the sequence signal of T2W1 scanningwas more significant than T1W1.Conclusion Theneuralstem celloriginated from rabbit BMSCs can survive，migrateand different iate after trans plantation.The T2W1 sequence imaging can clearly display the changeof low density imaging caused by Feridex labeled BMSCs.Using MRI can conduct thepreliminary in vivo trackingon labeled cellsafter transplantation.

【Keywords】Transplantation，autologous；Sciatic nerve；Magnetic resonance imaging；Feridex；Stromal cell

近年來干細(xì)胞療法已成為治療多種疾病的新策略，其目的是替代、修復(fù)及加強(qiáng)受損組織或器官的生物學(xué)功能。隨著干細(xì)胞研究的深入，有關(guān)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bonemarrow stormal cells，BMSCs）移植修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究也越來越多。本研究擬在合適示蹤劑幫助下，采用無創(chuàng)傷性影像學(xué)技術(shù)來在體識(shí)別、跟蹤移植后BMSCs的存活狀態(tài)及與宿主神經(jīng)組織整合情況，從而了解BMSCs移植周圍神經(jīng)后細(xì)胞如何遷移、凋亡、被吸收及被誰吞噬。最終為其進(jìn)一步行體內(nèi)自體移植治療的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物選取2～3月齡，體質(zhì)量為1.5～2.0 kg的新西蘭兔（由南華大學(xué)動(dòng)物中心提供）。

1.1.2試劑與儀器菲立磁（PE）試劑盒（Advanced Magnetic公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（b-FGF，R＆D公司）；白血病抑制因子（LIF）、細(xì)胞表皮因子（EGF）、PKH67染料試劑盒、3，3-二氨基苯聯(lián)胺試劑盒（DAB）、淋巴細(xì)胞分離液；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG試劑盒（Sigma公司）；兔神經(jīng)巢蛋白（Nestin）抗體、鼠抗單克隆神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）抗體（Santa Cruz公司）；神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制，專利號(hào)：02134314.4）。

1.1.3主要儀器外科手術(shù)器械：手術(shù)剪、彎剪、鑷子、血管鉗、顯微器械1套、縫針、無菌注射器等醫(yī)用超導(dǎo)磁共振儀（荷蘭PHILIP電器公司）。

1.2方法

1.2.1兔骨髓采集、BMSCs的分離、擴(kuò)增及分化鑒定將兔用水合氯醛靜脈注射麻醉后，無菌條件下于兔股骨處抽取骨髓約4mL。所獲骨髓用Hank′s液稀釋，細(xì)胞懸液與淋巴細(xì)胞分離液按1∶2比例混合，2 500 r/min密度梯度離心15min。吸取富含核細(xì)胞的界面層，加入1～2mL雙蒸水吹打，加入干細(xì)胞培養(yǎng)基，800 r/min離心約5min，小心去除上清液后加相同體積培養(yǎng)基，并加1%胎牛血清及LIF（10 ng/mL）及bFGF（10 ng/mL），接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5 d，見圖1、2。培養(yǎng)細(xì)胞均經(jīng)4%多聚甲醛固定，磷酸緩沖液（PBS）沖洗，一抗4℃孵育過夜，室溫孵育顯色劑染色呈棕色的細(xì)胞為陽性。以抗原表達(dá)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞、分化形成的神經(jīng)元、分化形成的膠質(zhì)細(xì)胞，見圖3、4。

圖1　相差顯微鏡下培養(yǎng)8 h的BMSCs細(xì)胞形態(tài)（200×）

圖2　第3代BMSCs細(xì)胞形態(tài)（200×）

圖3　相差顯微鏡下神經(jīng)元樣多突起細(xì)胞形態(tài)（400×）

圖4　相差顯微鏡下類神經(jīng)元細(xì)胞NSE免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（400×）

1.2.2PE體外標(biāo)記BMSCs將FE（50μg/mL）和多聚賴氨酸（PLL，1.5μg/mL）混合，振蕩30min，將FE-PLL混合物1∶1加入體外擴(kuò)增培養(yǎng)誘導(dǎo)后觀察存活良好的細(xì)胞培養(yǎng)基中。在37℃下培養(yǎng)10 d左右，室溫下用0.25%胰蛋白酶消化，用含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)并懸浮細(xì)胞，1 000 r/min離心5min，去除上清液，用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106μL-1，置40℃?zhèn)溆?，見圖5。

圖5　相差顯微鏡下FE標(biāo)記BMSCs普魯士藍(lán)染色（200×）

1.2.3兔坐骨神經(jīng)損傷模型的建立將兔稱質(zhì)量、麻醉，碘酒、乙醇消毒后，鋪一次性手術(shù)巾。隨機(jī)選擇移植側(cè)及對(duì)照側(cè)，行髖關(guān)節(jié)后入路，依次切開皮膚、皮下，分離臀部肌肉顯露并保護(hù)坐骨神經(jīng)，顯露坐骨神經(jīng)分支處，并在其上方約8mm處向上切開坐骨神經(jīng)外膜，銳性切除約8mm長(zhǎng)神經(jīng)。將肌膜縫合包裹神經(jīng)外膜以加強(qiáng)對(duì)移植干細(xì)胞的包裹力。移植的神經(jīng)干細(xì)胞用微量注射器在5min內(nèi)注入兔坐骨神經(jīng)缺損區(qū)內(nèi)，對(duì)照側(cè)注射DMEM培養(yǎng)液。最后再用明膠海綿包裹，在皮膚外標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組移植側(cè)。術(shù)后清潔籠具，給予青霉素以預(yù)防感染，并觀察動(dòng)物的生命體征。

1.2.4磁共振成像（MRI）檢查于細(xì)胞移植后第1、2、4、8、16周分別行MRI檢查。檢查時(shí)，動(dòng)物麻醉后俯臥位固定于有機(jī)玻璃板上，采用荷蘭PHILIP電器公司醫(yī)用超導(dǎo)磁共振儀常規(guī)定位后進(jìn)行T1加權(quán)像（T1WI）和T2加權(quán)像（T2WI）序列檢查。

2　結(jié)果

移植前臺(tái)盼蘭染色顯示活細(xì)胞數(shù)在96%左右。T2WI掃描序列信號(hào)較T1WI明顯，細(xì)胞移植1周時(shí)低信號(hào)改變區(qū)比較局限，見圖6a。但經(jīng)包裹的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞稍有外滲，移植4、8周后低信號(hào)改變?cè)龃螅妶D6b。移植16周后MRI檢查未能發(fā)現(xiàn)明顯低信號(hào)改變。

圖6　細(xì)胞移植1、8周后MRI檢查結(jié)果

3　討論

周圍神經(jīng)損傷殘疾率高、治療困難，是常見的臨床問題［1］，給社會(huì)及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。而作為一種新的治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷方法——體外分離培養(yǎng)獲得的BMSCs移植正成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)［2-3］。

由于BMSCs具有來源廣泛、強(qiáng)大的再生及分化潛能、體內(nèi)移植反應(yīng)弱、移植后可以在體內(nèi)分化出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，補(bǔ)充因各種原因?qū)е碌纳窠?jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的丟失［4］等優(yōu)點(diǎn)，因此，BMSCs移植治療一直是人們探索的目標(biāo)。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)與BMSCs有很大關(guān)系［5］。2007 年1月，Hu等［6］在恒河猴尺神經(jīng)缺損處移植BMSCs，結(jié)果證實(shí)BMSCs移植與自體神經(jīng)移植術(shù)后神經(jīng)恢復(fù)效果相當(dāng)，為BMSCs用來修復(fù)靈長(zhǎng)類動(dòng)物周圍神經(jīng)提供了有力的證據(jù)。2013年7月，Zhang等［7］將體外培養(yǎng)的BMSCs移植入大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損模型，12周后電生理檢測(cè)結(jié)果表明，再生神經(jīng)的傳導(dǎo)速度明顯改善，改善了大鼠的行走行為，減輕了腓腸肌質(zhì)量和復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CMAP）波幅的降低，并發(fā)現(xiàn)大量的再生軸突。2015年，Zhu等［8］取成年大鼠的BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增并標(biāo)記后移植入馬尾神經(jīng)損傷的大鼠中，術(shù)后12周顯示，大鼠馬尾神經(jīng)得到修復(fù)并恢復(fù)一定功能。

FE是用于靜脈給藥的MRIT2加權(quán)造影劑，其外周為葡萄糖包裹，理化性質(zhì)穩(wěn)定［9］。注入人體后，其顆粒主要被正常肝臟組織內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（庫普弗細(xì)胞）所吞噬，造成肝臟組織的T2值明顯縮短，使富含庫普弗細(xì)胞的正常肝組織背景信號(hào)降低。有研究發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)染試劑可以轉(zhuǎn)運(yùn)FE至細(xì)胞內(nèi)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)將超順磁性氧化鐵顆粒（SPIO）吞噬于BMSCs內(nèi)并移植到兔坐骨神經(jīng)缺損處，選擇SE-T2WI序列進(jìn)行MRI掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植入兔坐骨神經(jīng)內(nèi)的FE標(biāo)記BMCSs在移植初可發(fā)生局限性遷移，移植段周圍可見低信號(hào)影。而后低信號(hào)影逐漸消失，被機(jī)體所吸收、代謝。由此證明FE標(biāo)記的BMCSs與宿主坐骨神經(jīng)及肌組織有很好的相容性，對(duì)周圍結(jié)構(gòu)無明顯破壞。

本實(shí)驗(yàn)利用MRI成功活體觀察了FE標(biāo)記的干細(xì)胞在周圍神經(jīng)內(nèi)的定位與遷移情況。但是因MRI分辨率有限及掃描厚度過大等缺點(diǎn)，一些組織切片結(jié)果及微小影像變化尚不能完全敏感地反映出來。相信隨著MRI技術(shù)的進(jìn)步，有望追蹤到移植細(xì)胞更細(xì)微的影像變化。

綜上所述，F(xiàn)E標(biāo)記的兔骨髓基質(zhì)源神經(jīng)干細(xì)胞移植后，可在坐骨神經(jīng)內(nèi)存活、遷移、分化，利用MRI技術(shù)可以對(duì)移植后的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行初步的活體追蹤。

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本刊編輯部

Research on Feridex labeled bonemarrow stromal cellsautotransplant into rabbitsciatic nerve

He Xiao1，Deng Lili2，Zou Kang1
（1.First Department of Orthopedics，Central Hospital；2.Department of Pediatrics，North Branch Hospital，Chenzhou Municipal First People′s Hospital，Chenzhou，Hunan 423000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.011

A

1009-5519（2016）10-1468-03

何驍（1982-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事關(guān)節(jié)、創(chuàng)傷相關(guān)疾病的研究工作。

（2016-01-11）