夏德菊，譚亞軍，田霖，王珣，馬霄，肖詹蓉

·論著·

破傷風(fēng)類毒素原液質(zhì)量分析方法的研究

夏德菊，譚亞軍，田霖，王珣，馬霄，肖詹蓉

目的建立對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液進(jìn)行質(zhì)量分析的分子排阻色譜方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。

方法分別建立分子排阻色譜方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液?jiǎn)误w和聚體含量進(jìn)行分析，并對(duì)兩種方法的關(guān)鍵影響因素及兩種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。結(jié)果以含 1% 異丙醇的 pH 7.0，0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，選取 TSK-GEL G3000SWxl 色譜柱，可以對(duì)破傷風(fēng)類毒素單體、二聚體和多聚體分離，經(jīng)配套軟件分析得到其三個(gè)組分的相對(duì)含量；選用實(shí)驗(yàn)室自配的 10% 濃度的分離膠對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液進(jìn)行電泳后經(jīng) Image Lab 軟件分析可以對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液的單體和聚體進(jìn)行純度分析，兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有可比性。

結(jié)論建立的兩種檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素原液?jiǎn)误w和聚體含量的方法能夠?qū)λ瑔误w、二聚體和多聚體進(jìn)行分離和定量，兩種方法相輔相成，可以對(duì)生產(chǎn)的破傷風(fēng)類毒素原液批間一致性進(jìn)行監(jiān)控和用于不同目的的破傷風(fēng)類毒素質(zhì)量情況進(jìn)行監(jiān)督。

破傷風(fēng)類毒素；電泳，聚丙烯酰胺凝膠；分子排阻色譜；單體；二聚體；多聚體

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)， 2016， 11（4）：333-339

破傷風(fēng)疫苗作為常規(guī)計(jì)劃免疫品種已廣泛應(yīng)用到嬰幼兒和適宜人群的預(yù)防接種，其生產(chǎn)工藝也一直沿用傳統(tǒng)的技術(shù)：即培養(yǎng)細(xì)菌收獲其毒素，毒素經(jīng)甲醛脫毒、精制或精制后經(jīng)甲醛脫毒制成類毒素，再和鋁佐劑吸附制成成品。因此破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT 或 TTd）的制備是此疫苗的基礎(chǔ)。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外細(xì)菌性結(jié)合疫苗的發(fā)展，破傷風(fēng)類毒素作為載體蛋白質(zhì)的應(yīng)用也得到加強(qiáng)［1-3］。但有文獻(xiàn)報(bào)道，破傷風(fēng)類毒素的制備過程中，甲醛脫毒處理會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)合物的產(chǎn)生，因?yàn)樵诙舅氐慕舛具^程中，脫毒劑與毒素分子，蛋白胨和培養(yǎng)基中的其他蛋白分子反應(yīng)［4］。這些反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致三種形式的交聯(lián)，產(chǎn)生三種類型的產(chǎn)物，即①一個(gè)毒素分子內(nèi)的交聯(lián)，仍是單體，但是分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；②毒素分子之間的交聯(lián)，形成二聚體或多聚體；③毒素分子與培養(yǎng)基中的肽或雜蛋白交聯(lián)［5］。目前各廠家的生產(chǎn)工藝和脫毒工藝也存在一些差別：如脫毒和精制順序不一致，脫毒方法和脫毒劑不一致，這些差別也加大了不同廠家之間的破傷風(fēng)類毒素原液的質(zhì)量差異。

破傷風(fēng)類毒素作為結(jié)合疫苗的載體蛋白應(yīng)以分子質(zhì)量相對(duì)較小的 TT 單體純化蛋白為首選，而作為預(yù)防破傷風(fēng)的 TT 抗原需要綜合考慮抗原分子的免疫原性和聚合體引起的致敏性［6-11］。因此，對(duì)破傷風(fēng)原液的單體和聚體含量的分析就顯得尤其重要了，《中國(guó)藥典》2015 年版對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液列出的檢測(cè)項(xiàng)目只有絮狀單位測(cè)定、pH 值、純度、無菌檢查、特異性毒性檢查和毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)，因此有必要對(duì)各個(gè)廠家生產(chǎn)的原液進(jìn)一步用生化和免疫學(xué)方法對(duì)其單體和聚體含量進(jìn)行分析，以保證用于不同目的的破傷風(fēng)類毒素原液有明確的單體和聚體含量，并確保疫苗原液的批間一致性，保持足夠的免疫原性和安全性。

本文擬建立分子排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC）方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）方法對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液的單體和聚體含量進(jìn)行分析，以為國(guó)產(chǎn)破傷風(fēng)類毒素原液的質(zhì)量穩(wěn)定性研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1TT 原液由北京天壇生物制品股份有限公司菌苗室提供。

1.1.2凝膠過濾蛋白Marker 試劑盒（貨號(hào)MWGF1000）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品 1：轉(zhuǎn)鐵蛋白（443 kD）、標(biāo)準(zhǔn)品 2：乙醇脫氫酶（150 kD）和標(biāo)準(zhǔn)品 3：葡聚糖藍(lán)（66 kD）。

1.1.3主要試劑及儀器甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、SDS、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、過硫酸鈉、甘氨酸、TEMED 為美國(guó) Amresco 公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán) R250、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；預(yù)染蛋白 marker 購(gòu)自賽默飛公司；10% 濃度預(yù)制電泳膠和電泳儀為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng) ImageMaster VDS 為美國(guó) GE Healthcare 產(chǎn)品；高效液相色譜儀為島津 LC-20A 公司產(chǎn)品；TSK-GEL G3000SWxl色譜柱為日本 Tosoh 公司產(chǎn)品；Agilent SEC-3 色譜柱為安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1分子排阻色譜方法的建立

1.2.1.1色譜條件的確定參照《中國(guó)藥典》三部（2015 年版）通則中“分子排阻色譜方法”的一般要求，并參考“人免疫球蛋白類制品 IgG 單體加二聚體測(cè)定法”，確定本方法的色譜條件。

1.2.1.2色譜柱的比較按照確定的色譜條件，分別用 TSK-GEL G3000SWxl 和 Agilent SEC-3兩種色譜柱對(duì) TT 原液進(jìn)行分析，比較兩者的分離效果。

1.2.1.3確定 TT 保留時(shí)間用確定的色譜條件和色譜柱對(duì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和 TT 原液分別進(jìn)行分析，從標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和 TT 蛋白分子量（150 kD）確定 TT 單體、二聚體、多聚體的保留時(shí)間。

1.2.1.4TT 原液?jiǎn)误w和聚體含量分析按照確定的分子排阻色譜方法和確定的各組分保留時(shí)間，對(duì) 7 批 TT 原液分析后運(yùn)用島津液相系統(tǒng)配套分析軟件，按照面積歸一法，對(duì)每一樣品的單體、二聚體和多聚體相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2SDS-PAGE 方法的建立

1.2.2.1電泳條件的確定參照《中國(guó)藥典》三部（2015 年版）通則中“SDS-PAGE 凝膠電泳法”的一般要求，確定本方法的電泳條件。

1.2.2.2分離膠濃度的選擇按照確定的電泳條件，選用了 10% 和 8% 兩個(gè)濃度的分離膠，比較其對(duì)破傷風(fēng)原液的分離效果。

1.2.2.3不同來源電泳膠的比較選用了實(shí)驗(yàn)室自配的 10% 濃度分離膠和商業(yè)購(gòu)買的 10% 分離膠，比較其對(duì)破傷風(fēng)原液的分離效果。

1.2.2.4TT 原液?jiǎn)误w和聚體含量分析電泳膠脫色完成后用凝膠成像儀及 Image Lab 軟件對(duì)每一批樣品所含單體、二聚體和多聚體相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。

2　結(jié)果

2.1分子排阻色譜方法的建立

2.1.1色譜條件用島津高效液相層析系統(tǒng)，以含 1% 異丙醇的 pH 7.0，0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm，流速為 0.6 ml/min，上樣量 10 μl，分析時(shí)間 30 min，記錄色譜圖。

2.1.2色譜柱的選擇從圖 1 兩種色譜柱的重疊色譜圖可以看出 TSK-GEL G3000SWxl 色譜柱對(duì) TT 單體、二聚體和多聚體的分離效果要優(yōu)于Agilent SEC-3 色譜柱。因此，選取 TSK-GEL G3000SWxl 色譜柱作為本方法的分析色譜柱。

圖1　Agilent SEC-3 色譜柱（A）和 TSK-GEL G3000SWxl色譜柱（B）對(duì) TT 原液的分離色譜圖Figure 1　Separation chromatogram of TT liquid by Agilent SEC-3 column （A） and TSK-GEL G3000SWxl column （B）

2.1.3TT 原液中單體和聚體保留時(shí)間的確定結(jié)合 TT 蛋白分子量和凝膠過濾蛋白 marker試劑盒中三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及 TT 原液的圖譜分析，可確定 TT 單體、二聚體和多聚體的保留時(shí)間，即確定其特征吸收峰（圖 2）。

2.1.4TT 原液?jiǎn)误w和聚體含量分析結(jié)果7 批TT 原液液相重疊圖譜見圖 3，經(jīng)計(jì)算其單體、二聚體和多聚體相對(duì)含量見表 1。

2.2SDS-PAGE 分析結(jié)果

2.2.1電泳條件的確定應(yīng)用 Bio-Rad 垂直電泳儀，上樣緩沖液中不含 DTT，所有樣品上樣體積為 20 μl/孔。電泳開始時(shí)設(shè)置電壓為 80 V，樣品進(jìn)入分離膠后電壓設(shè)為 120 V，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。然后將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染液中染色 3 h，最后經(jīng)脫色液脫色直至背景無色后觀察，和標(biāo)準(zhǔn)蛋白 marker 比對(duì)，破傷風(fēng)原液?jiǎn)误w、二聚體和多聚體的條帶對(duì)應(yīng)位置如圖 4 所示。

2.2.2分離膠濃度的確定從圖 5 可以得出 8%分離膠跑出的電泳圖中各條帶更彌散，而 10% 分離膠的電泳圖各條帶聚合效果好，分離度也較好，更易于最后軟件的分析，因此本方法選用 10% 分離膠對(duì)破傷風(fēng)原液進(jìn)行分析。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品和 TT 原液的分離色譜圖Figure 2　Standard and TT liquid separation chromatogram

圖3　7 批 TT 原液色譜圖Figure 3　Chromatogram of seven batches TT liquid

表1　7 批 TT 原液?jiǎn)误w、二聚體和多聚體相對(duì)含量（%）Table 1　The monomers， dimers and multimers relative content of seven batches TT liquid （%）

圖4　TT 原液 SDS-PAGE 分析Figure 4　SDS-PAGE analysis of TT liquid

圖5　TT 原液在不同濃度分離膠上的 SDS-PAGE 分析（A：10% 濃度分離膠；B：8% 濃度分離膠）Figure 5　SDS-PAGE separating analysis of TT liquid at different concentration gels （A： 10% separating gel； B： 8% separating gel）

2.2.3電泳膠來源的比較從圖 6 可以看出實(shí)驗(yàn)室自配膠對(duì)二聚體的聚合效果要優(yōu)于商業(yè)購(gòu)買的膠，因此本方法最終選用實(shí)驗(yàn)室自配的電泳膠。

2.2.4TT 原液?jiǎn)误w和聚體含量分析結(jié)果7 批TT 原液電泳圖譜如圖 7 所示，經(jīng)計(jì)算其單體、二聚體和多聚體相對(duì)含量見表 2。

3　討論

TT 作為單價(jià)或吸附百白破疫苗的主要成分已廣泛用于嬰幼兒及適宜人群的預(yù)防接種，其安全性已得到普遍認(rèn)可，但是接種破傷風(fēng)疫苗后的過敏反應(yīng)一直都有報(bào)道［9-12］。破傷風(fēng)毒素用甲醛脫毒過程中會(huì)出現(xiàn)蛋白聚集現(xiàn)象，一般是大分子蛋白的免疫原性要優(yōu)于小分子蛋白，但過量的大分子蛋白可能會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)致敏現(xiàn)象，但目前并沒有統(tǒng)一方法對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液的單體和聚體含量進(jìn)行檢測(cè)。

圖6　TT 原液在不同來源電泳膠上的 SDS-PAGE 分析（A：實(shí)驗(yàn)室自配膠；B：商業(yè)購(gòu)買預(yù)制膠）Figure 6　SDS-PAGE separating analysis of TT liquid on different sources gels （A： Gel prepared in laborarory； B： Gel purchased from market）

圖7　7 批 TT 原液電泳圖譜Figure 7　Electrophoresis chart of seven batches TT liquid

表2　7 批 TT 原液 SDS-PAGE 方法檢測(cè)單體、二聚體和多聚體含量（%）Table 2　The monomers， dimers and multimers relative content detected by SDS-PAGE method of seven batches TT liquid （%）

本研究建立了分子排阻色譜方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液的單體和聚體含量進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，兩種方法都能對(duì)破傷風(fēng)原液的單體、二聚體和多聚體進(jìn)行分離，從檢測(cè)結(jié)果來看，電泳方法對(duì) TT 原液中單體的檢測(cè)結(jié)果要普遍高于分子排阻方法，這可能有以下幾個(gè)原因：首先，SDS-PAGE 方法的靈敏度不如分子排阻色譜方法，有些樣品所含聚體和雜質(zhì)含量比較少，電泳方法并未檢測(cè)出；其次，破傷風(fēng)毒素在純化脫毒過程中，可能產(chǎn)生了一些小肽片段，或者是一些核酸類和肽聚糖類物質(zhì)未除去，導(dǎo)致色譜系統(tǒng)的紫外分光光度計(jì)有信號(hào)記錄而電泳方法無法顯示出條帶，最后，脫毒劑對(duì)破傷風(fēng)毒素的處理過程導(dǎo)致破傷風(fēng)類毒素原液的電泳圖譜出現(xiàn)拖尾，背景較深，這影響了 Image Lab 軟件對(duì)電泳圖譜的分析。所以，分子排阻方法應(yīng)該是結(jié)果相對(duì)精確的一種方法，但是相比較而言，SDS-PAGE 方法更簡(jiǎn)單易行，結(jié)果直觀可靠，7 批樣品檢測(cè)結(jié)果的總體趨勢(shì)是可以和分子排阻方法對(duì)應(yīng)的，若實(shí)驗(yàn)室不具備高壓液相層析系統(tǒng)，可以選擇 SDS-PAGE 方法對(duì)破傷風(fēng)原液脫毒后單體和聚體含量進(jìn)行檢測(cè)，具備條件的實(shí)驗(yàn)室，可以選用這兩種方法分別進(jìn)行檢測(cè)，以使檢測(cè)結(jié)果更直觀可靠。

綜上所述，本文建立的兩種檢測(cè) TT 原液?jiǎn)误w和聚體含量的方法能夠?qū)λ瑔误w、二聚體和多聚體進(jìn)行分離和定量，兩種方法相輔相成，可以對(duì)生產(chǎn)的破傷風(fēng)類毒素原液批間一致性進(jìn)行監(jiān)控和用于不同目的的破傷風(fēng)類毒素質(zhì)量情況進(jìn)行監(jiān)督。后續(xù)系列工作首先將進(jìn)一步對(duì)影響電泳方法的因素進(jìn)行分析，即對(duì)分子排阻方法保留時(shí)間較長(zhǎng)的峰進(jìn)行回收鑒定；然后還要對(duì)破傷風(fēng)類毒素原液中不同分子質(zhì)量的成分進(jìn)行免疫學(xué)分析，為以破傷風(fēng)類毒素為載體或聯(lián)合的疫苗的安全性和免疫原性提供更多研究數(shù)據(jù)。

［1］ Tontini M， Berti F， Romano MR， et al. Comparison of CRM197，diphtheria toxoid and tetanus toxoid as protein carriers for meningococcal glycoconjugate vaccines. Vaccine， 2013， 31（42）：4827-4833.

［2］ WHOExpertCommitteeonBiologicalStandardization. Recommendations to assure the quality， safety and efficacy of pneumococcalconjugatevaccines.Geneva：WorldHealth Organization， 2009 ［2016-01-29］. http：//www.who.int/biologicals/ areas/vaccines/pneumo/Pneumo_final_23APRIL_2010.pdf？ua=1.

［3］ Centers for Disease Control and Prevention （CDC）. Updated recommendations for use of tetanus toxoid， reduced diphtheria toxoid and acellular pertussis （Tdap） vaccine from the Advisory Committee on Immunization Practices， 2010. MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2011， 60（1）：13-15.

［4］ Aggerbeck H， Heron I. Detoxification of diphtheria and tetanus toxin with formaldehyde. Detection of protein conjugates. Biologicals， 1992，20（2）：109-115.

［5］ Relyveld EH， Henocq E， Bizzini B. Studies on untoward reactions to diphtheria and tetanus toxoids. Dev Biol Stand， 1979， 43：33-37.

［6］ Vesikari T， Wysocki J， Chevallier B， et al. Immunogenicity of the 10-valent pneumococcal non-typeable Haemophilus influenza protein D conjugate vaccine （PHiD-CV） compared to the licensed 7vCRM vaccine. Pediatric Infect Dis J， 2009， 28（4 Suppl）：S66-S76.

［7］ Gross S， Janssen SW， de Vries B， et al. Collaborative study for the validation of alternative in vitro potency assays for human tetanus immunoglobulins. Biologicals， 2010， 38（4）：501-510.

［8］ Montecucco C， Schiavo G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q Rev Biophys， 1995， 28（4）：423-472.

［9］ Peng XB. The development history of tetanus toxoid， current situation and research progress of new type tetanus vaccine. Prog Microbiol Immunol， 1997， 25（2）：54-56. （in Chinese）

彭祥兵. 破傷風(fēng)類毒素的發(fā)展歷史、現(xiàn)狀和新型破傷風(fēng)疫苗的研究進(jìn)展. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 1997， 25（2）：54-56.

［10］ Hao MY. Joint DPT vaccine cause allergic reactions in 1 case. Chin J Vaccines Immunization， 2005， 11（5）：342. （in Chinese）

郝美瑩. 接種百白破聯(lián)合疫苗致超敏反應(yīng) 1例. 中國(guó)計(jì)劃免疫，2005， 11（5）：342.

［11］ Duan XY， Chen SJ， Zhou RG， et al. The DPT vaccine Arthus reaction in 1 case. China Rural Health， 2013， （6）：61. （in Chinese）

段旭云， 陳少軍， 周榮光， 等. 接種百白破疫苗致Arthus反應(yīng)1例.中國(guó)農(nóng)村衛(wèi)生， 2013， （6）：61.

［12］ Deng ZH， Zeng HS. Report one case about DTP vaccine allergies caused hands redden swelling itching 36 days and review of literature. J Qiqihar Univ Med， 2012， 33（15）：2052-2054. （in Chinese）

鄧朝暉， 曾海生. 百白破疫苗過敏致雙手發(fā)紅腫脹瘙癢36天1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí). 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 33（15）：2052-2054.

【Abstract】

ObjectiveTo establish size exclusion chromatography （SEC） method and polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） method for quality analysis of tetanus toxoid （TT） bulk.

MethodsSEC method and SDS-PAGE method were established to analyze the monomer and polymer contents of tetanus toxoid，furthermore， the key factors and results of the two methods were evaluated.

ResultspH 7.0， 0.2 mol/L phosphate buffer containing 1% isopropanol was selected as the mobile phase and TSK-GEL G3000SWxl column， TT monomers， dimers and multimers were separated， and then the three components of TT were obtained by supporting software analysis. TT also were separated after electrophoresis by choosing 10% concentration of gel preparing by our own laboratory software.

ConclusionThe dimers and multimers of TT are separated and quantified by the established two methods， and the two methods complement each other. They are used to monitor the consistency of different batches of tetanus toxoid and supervise the quality of tetanus toxoid.

Author Affiliations： Beijing Tiantan Biological Products Co.，Ltd.， Beijing 100176， China （XIA De-ju， WANG Xun， XIAO Zhan-rong）； National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China （TAN Ya-jun， TIAN Lin， MA Xiao）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：333-339

Study on quality analysis method for tetanus toxoid

XIA De-ju， TAN Ya-jun， TIAN Lin， WANG Xun， MA Xiao， XIAO Zhan-rong

Tetanus toxoid；Electrophoresis， polyacrylamide gel；Size exclusion chromatography；Monomer；Dimer；Multimers

TAN Ya-jun， Email： tyj.tyj@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.009

100176 北京天壇生物制品股份有限公司（夏德菊、王珣、肖詹蓉）；100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院（譚亞軍、田霖、馬霄）

譚亞軍，Email：tyj.tyj@163.com

2016-02-22