馮　磊　李元敬　劉健美　佟立君

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱　150081）

食用菌天然復(fù)合防腐劑的研制*

馮磊李元敬劉健美佟立君**

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱150081）

以S.aureus和E.coli為指示菌，采用杯碟法考察榆耳水提液和黑木耳多糖、Nisin、殼聚糖4種天然防腐劑的抑菌能力，單因素研究結(jié)果表明，榆耳水提液、黑木耳多糖、殼聚糖對E.coli的抑菌效果強(qiáng)于S.aureus，而Nisin對S.aureus的抑制效果更好。正交試驗結(jié)果表明，天然復(fù)合防腐劑具有更強(qiáng)的抑菌效果，其最優(yōu)配比為：榆耳干物質(zhì)含量為2%，黑木耳多糖干物質(zhì)含量為1.6%，Nisin為1%，殼聚糖為0。

食用菌；榆耳水提液；黑木耳多糖；防腐劑；抑菌

食用菌不僅味道鮮美，其所含多糖等還具有抗癌、提高免疫力的功效［1］，所以深得人們喜愛。作為季節(jié)性產(chǎn)品，食用菌儲存保鮮過程中容易受到環(huán)境影響，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，因此，如何延長保存期、并使其保持良好色澤及外觀，是當(dāng)前食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要問題。

天然防腐劑作為安全無毒、天然綠色的生物物質(zhì)，用其替代傳統(tǒng)的化學(xué)類防腐劑已是必然。Nisin雖是一種公認(rèn)的安全天然防腐物質(zhì)［2］，但因抗菌譜比較窄，使其應(yīng)用受到限制［3］。而將Nisin與其他防腐劑配合使用所制備的復(fù)合生物防腐劑不僅可以彌補(bǔ)其缺點，而且可發(fā)揮廣譜抑菌作用。鑒于目前針對食用菌的天然防腐劑研究比較少見，實際大規(guī)模生產(chǎn)中未見廣泛應(yīng)用的現(xiàn)狀，本研究將榆耳子實體提取液、黑木耳多糖及Nisin、殼聚糖進(jìn)行復(fù)配，研制出適用于食用菌保鮮的天然、安全復(fù)合防腐劑，現(xiàn)將有關(guān)研究結(jié)果報道如下。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料

黑木耳為黑龍江元寶2號；榆耳由黑龍江省林副特產(chǎn)研究所提供；殼聚糖，脫乙酰度80.0～95.0（國藥試劑）；Nisin，分子量3 354.07 g/mol（偉日生物）；大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存。

1.2試驗方法

1.2.1天然防腐劑的原材料制備

榆耳水提液：榆耳60℃烘至恒重，準(zhǔn)確稱取200 g，10倍水浸泡24 h后開始加熱，水沸后繼續(xù)加熱90min，之后加水?dāng)嚢?，并用多層紗布過濾。將過濾物繼續(xù)加水加熱至沸騰，30 min后用紗布濾液。將兩次濾液合并，減壓過濾濃縮蒸干，獲得干物質(zhì)20 g，將其溶入200 mL無菌水中，即為榆耳水提液，其干物質(zhì)含量為10%。

黑木耳多糖溶液：黑木耳50 g干燥（70℃，3 h）→粉碎→100目篩子過篩→粉末加水500 mL混合→超聲波破碎→熱水浸提1h→離心（3000 r/min，15 min）→抽濾→取上清液→減壓旋蒸濃縮蒸干，獲得干物質(zhì)4 g，將其溶入50 mL無菌水中，即為黑木耳多糖溶液，多糖含量為8%。

殼聚糖溶液：用1%乙酸將其制備成1%、2%、3%三個濃度。

Nisin溶液：用無菌水將Nisin制備成0.5%、1%、2%三個濃度。

1.2.2試驗設(shè)計

單因素試驗：以S.aureus和E.coli為指示菌，按表1配制不同濃度梯度的榆耳水提液和黑木耳多糖、殼聚糖、Nisin溶液進(jìn)行單因素試驗，其中榆耳水提液和黑木耳多糖溶液采用原液倍比稀釋的方法進(jìn)行濃度梯度稀釋。

表1　單因素試驗濃度梯度　%

正交試驗：以S.aureus和E.coli為指示菌，將榆耳水提液和黑木耳多糖、Nisin、殼聚糖溶液按正交實驗因素水平進(jìn)行復(fù)配，濃度組分別為（A1、A2、A3）、（B1、B2、B3）、（C1、C2、C3）、（D1、D2、D3），即榆耳提取干物質(zhì)（0%、1%、2%），黑木耳多糖干物質(zhì)（0%、0.8%、1.6%），Nisin（0%、1%、2%），殼聚糖（0%、1%、2%），進(jìn)行4因素3水平正交試驗（表2）。

單因素和正交試驗方法的抑菌試驗均采用杯碟法，測量抑菌圈的直徑，并對比Nisin效價標(biāo)準(zhǔn)曲線計算效價［4］。

表2　正交試驗因素水平表%

1.2.3Nisin效價標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將Nisin用0.02mol/L的 HCl稀釋至 10-2、10-3等濃度，采用杯蝶法，測量抑菌圈的直徑，利用y=a×lg（x）+b，得出a，b值，繪制Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算可得出其效價。由Nisin效價標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）可以看出，回歸方程y=6.328 9x+4.032 2，相關(guān)系數(shù)0.992 2，符合要求。

圖1　Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線

2　結(jié)果與分析

由圖2可以看出，榆耳水提液對S.aureus和E.coli均有抑制生長作用。當(dāng)榆耳水提液的干物質(zhì)含量從2%、5%、10%遞增時，抑菌作用逐漸增強(qiáng)。榆耳水提液的干物質(zhì)含量為2%時，其對E.coli抑菌作用已大于2%Nisin作用，效價為24 IU/mL。干物質(zhì)含量為5%時，呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌作用，對E.coli和S.aureus的抑菌效價分別為52 IU/mL、45 IU/mL。干物質(zhì)含量達(dá)到10%時，對E.coli呈現(xiàn)最強(qiáng)的抑制效果，效價達(dá)到96 IU/mL，對S.aureus的抑菌效價68 IU/mL。表明榆耳水提液對S.aureus和E.coli均呈很好的抑菌效果，相比之下，其對E.coli抑制能力優(yōu)于S.aureus。

圖2　榆耳水提液對2種菌的抑菌效價

2.2不同濃度黑木耳多糖的抑菌效果

由圖3可以看出，不同濃度黑木耳多糖對2種指示菌都有不同程度的抑菌作用，隨著干物質(zhì)含量的增加，抑菌效果明顯增強(qiáng)。干物質(zhì)含量為2%時，對E.coli起部分抑制作用，效果大于2%Nisin，抑菌效價為19 IU/mL；但對S.aureus的效果不明顯，抑菌效價僅為6 IU/mL，此時2%Nisin的抑菌效價為54 IU/mL。干物質(zhì)含量為8%時，對E.coli有很好的效果，抑菌效價為68 IU/mL；但對S.aureus仍不如2%Nisin。試驗結(jié)果表明，黑木耳多糖對E.coli抑制能力優(yōu)于S.aureus。

圖3　黑木耳多糖對2種菌的抑菌效價

2.1不同濃度榆耳水提液的抑菌效果

2.3不同濃度殼聚糖的抑菌效果

由圖4可以看出，這2種指示菌都受殼聚糖抑制，且隨著殼聚糖含量的升高，抑制能力增強(qiáng)。當(dāng)含量為2%時，對E.coli抑菌效價為21 IU/mL。當(dāng)含量為3%時，對E.coli、S.aureus的抑菌效價分別為80 IU/mL、40 IU/mL；此時殼聚糖對E.coli的抑菌能力顯著強(qiáng)于2%Nisin，但對S.aureus的抑菌能力仍低于2%Nisin。

圖4　殼聚糖對2種菌的抑菌效價

2.4不同濃度Nisin抑菌效果

由圖5可以看出，Nisin對S.aureus有較強(qiáng)的抑菌作用，當(dāng)Nisin濃度為1%時，抑菌效價達(dá)到20 IU/mL；當(dāng) Nisin含量為 2%，抑菌效價達(dá)到54 IU/mL。Nisin對E.coli無顯著抑制，且隨含量升高抑制能力升高不顯著。這說明Nisin對S.aureus有較強(qiáng)的抑制作用，對E.coli無明顯抑制作用。

圖5　Nisin對2種菌的抑菌效價

2.5天然復(fù)合防腐劑的優(yōu)化

榆耳水提液和黑木耳多糖、殼聚糖、Nisin溶液對E.coli、S.aureus有不同的抑制效果。正交試驗結(jié)果（表3～表6）表明，對S.aureus來說，從極差水平可以看出，主次因素A＞B＞D＞C，從均值上可以確定最優(yōu)水平為A3B3C2D1；對E.coli來說，從極差水平可以看出，主次因素A＞D＞C＞B，從均值上可以確定最優(yōu)水平為A3B3C2D1。方差分析表明，榆耳水提液影響復(fù)配液的抑菌能力作用最明顯。

表3　正交復(fù)配液對S.aureus抑菌效果

表4　正交復(fù)配液對S.aureus抑菌效果方差分析

表5　正交復(fù)配液對E.coli抑菌效果

表6　正交復(fù)配液對E.coli抑菌效果方差分析

3　結(jié)論與討論

3.1榆耳是一種具有藥理作用的藥用真菌，含有多種生物活性成分。劉瑞君［5］對榆耳子實體浸提液進(jìn)行抑菌測定的結(jié)果顯示，其對綠膿桿菌和痢疾表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，其次是大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。崔京春［6］研究發(fā)現(xiàn)，榆耳發(fā)酵液對12株供試菌中的大多數(shù)菌表現(xiàn)出了抑菌作用，且對革蘭氏陽性菌抑制作用好于E.coli等革蘭氏陰性菌，對酵母無抑制效果。我們研究發(fā)現(xiàn)，榆耳子實體提取液抑制革蘭氏陰性菌（E.coli）能力強(qiáng)于革蘭氏陽性菌（S.aureus），這可能與抑菌物質(zhì)的來源不同有關(guān)。

3.2黑木耳多糖是一種生物活性大分子，趙夢瑤等［7］研究表明，黑木耳多糖對S.aureus和E.coli抑菌效果較強(qiáng)，我們的研究結(jié)果與此相同。

3.3殼聚糖已被多個國家批準(zhǔn)作為食品添加劑使用，Roller和Covill［8］研究了殼聚糖在飲料中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其對酵母真菌和霉菌有較好的抑菌效果，證明了其在食品中作為防腐劑的潛力。Staroniewicz［9］等通過實驗確定了殼聚糖抑制微生物的MIC。Tsai等［10］認(rèn)為，殼聚糖是通過破壞細(xì)胞膜殺死細(xì)菌，而細(xì)菌細(xì)胞膜損壞與殼聚糖的含量密切相關(guān)。張燕婉［11］報道了殼聚糖溶液濃度在0.5%～2.5%范圍內(nèi)對E.coli等菌有很好的抑菌效果，但許多因素影響著殼聚糖的抑菌能力，如溫度、脫乙酰度等。

3.4Nisin是當(dāng)前一種受到人們極為重視的天然防腐劑［12］。Nisin是帶正電荷的疏水短肽，它可以作用在革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁上帶負(fù)電荷的陰離子成分上，并與細(xì)胞壁形成管狀結(jié)構(gòu)，使得小分子量的細(xì)胞組成成分從孔道中泄露出來。因而Nisin對革蘭氏陽性菌具有很好的抑制作用，而對其他細(xì)菌沒有顯著作用［13］。本試驗同樣證實Nisin對革蘭氏陽性菌S.aureus的抑制效果較好，而對革蘭氏陰性菌E.coli的抑制效果不好。

3.5雖然榆耳水提液和黑木耳多糖、殼聚糖、Nisin溶液這些天然防腐劑對S.aureus和E.coli均呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌效果，但對不同菌有不同敏感性，抗菌譜也較窄。因此，本研究將4種天然抑菌物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配，采用正交試驗對其進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果表明，復(fù)合防腐劑對E.coli和S.aureus均有較強(qiáng)抑菌作用，其中榆耳水提液對復(fù)配液有顯著影響，其次為Nisin，再次為黑木耳多糖，最后是殼聚糖。復(fù)合防腐劑的最佳配比為：榆耳干物質(zhì)含量為2%，黑木耳多糖干物質(zhì)含量為1.6%，Nisin 1%，殼聚糖0。

［1］張華，王振宇，楊鑫，等.黑木耳多糖的羧甲基化及其對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用［J］.食品與機(jī)械，2011（3）:42-44+67.

［2］Joo N E，Ritchie K，Kamarajan P，et al.Nisin，an apoptogenic bacteriocin and food preservative，attenuates HNSCCtumorigenesis via CHAC1［J］.Cancer medicine，2012，1（3）:295-305.

［3］Yamazaki K，Murakami M，Kawai Y，et al.Use of nisin for inhibition of Alicyclobacillus acidoterrestris in acidic drinks［J］. Food microbiology，2000，17（3）:315-320.

［4］焦世耀.管碟法測定Nisin效價的改進(jìn)［J］.食品科學(xué)，2005，26（5）:165-166.

［5］劉瑞君，李鳳珍.榆耳的抗炎性研究［J］.中國食用菌，1990，9（3）:9-10.

［6］崔京春，郭海勇，邢效瑞，等.榆耳發(fā)酵液抑菌譜及抑菌作用穩(wěn)定性研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013，13:105-107.

［7］趙夢瑤，孔學(xué)瓊，張擁軍，等.不同處理工藝對黑木耳多糖抑菌活性影響研究［J］.中國食用菌，2011（2）:34-36.

［8］Roller S，Covill N.The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice［J］.International Journal of Food Microbiology，1999，47（1）:67-77.

［9］Staroniewicz Z，Ramisz A，Wojtasz-Pajak A，et al.Studies on antibacterial and antifungal activity of chitosan［J］.Chitin World. Wirtschaftverlag，Germany，1994:374-377.

［10］Tsai G J，Su W H.Antibacterial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli［J］.Journal of Food Protection，1999，62（3）:239-243.

［11］張燕婉.殼聚糖對五種食物中毒菌生長的影響［J］.微生物學(xué)報，1999，18（6）:344-347.

［12］Pattanayaiying R，Aran H，Cutter C N.Effect of lauric arginate，nisinZ，andacombinationagainstseveralfood-related bacteria［J］.International journal of food microbiology，2014，188:135-146.

［13］于見亮.冷卻羊肉菌相分析及應(yīng)用天然防腐劑復(fù)合保鮮技術(shù)的研究［D］.石河子大學(xué)，2008.

第1作者簡介：馮磊（1981-），男，副研究員，主要從事非木材產(chǎn)品資源加工利用方面的研究。

（責(zé)任編輯：王岳）

Development of Natural Compound Preservative for Edible Fungi

FENGLei
（Heilongjiang Academy of Forestry，Harbin150081）

With S.aureus and E.coli as the test bacteria，using the cup plate method，investigation of Gloeostereum water extract，auricularia auricula polysaccharide，Nisin，Chitosan，antibacterial activity of natural preservatives.The results showed that the inhibitory effect of Gloeostereum incarnatum water extract，Auricularia auricula polysaccharide，Chitosan on E.coli strong in S.aureus，and Nisin on S.aureus better.The results of orthogonal test showed that the natural compound preservative had stronger antibacterial effect. The optimal ratio of compound natural preservative:Gloeostereum incarnatum dry matter content was 2%，Auricularia auricula polysaccharide 1.6%，Nisin 1%，Chitosan 0%.

Edible fungus；Gloeostereum incarnatum water extract；Auricularia polysaccharide；Antiseptic；Antibacterial

S718.81，TQ458

A

1001-9499（2016）04-0064-05

*黑龍江省森林工業(yè)總局重點科研攻項目sgzjY2012008；黑龍江省省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項

佟立君（1968-），男，研究員，從事非木質(zhì)林產(chǎn)品加工、保藏方面研究。

2016-07-02