陳方奇，劉回民，鄭明珠，靳　松，劉景圣

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林　長春　130118；2 小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林　長春　130118；3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林　長春　130118)

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科學(xué)實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面法分析玉米半胱氨酸蛋白酶活性影響因素*

陳方奇1,2，劉回民2,3，鄭明珠1,2，靳松1，劉景圣1,2

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2 小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118；3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118)

玉米半胱氨酸蛋白酶(zea mays Cysteine Protease)是一類重要的蛋白水解酶，為了研究玉米半胱氨酸蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)，用重組畢赤酵母表達(dá)玉米半胱氨酸蛋白酶，以玉米半胱氨酸蛋白酶的相對酶活力為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法分析pH、溫度、MgCl2濃度對該酶活性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH 5.95，溫度55.89 ℃，MgCl2濃度6.08 mM，預(yù)測的相對酶活力為166.78%，實(shí)測值為167.13%。模型合理，有參考價值。

玉米半胱氨酸蛋白酶；發(fā)酵；響應(yīng)面法；酶活

半胱氨酸蛋白酶是以Cys-His-Asn/Glu氨基酸序列為活性中心的一類酶，廣泛分布于從病毒至脊椎動物的生物體中[1-2]。半胱氨酸蛋白酶是植物體內(nèi)重要的蛋白水解酶，參與多種生理過程[3-7]。該酶的最適溫度和pH和穩(wěn)定性具有滿足食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)運(yùn)用的先天優(yōu)勢[8-9]。

玉米不僅是重要的糧食作物，也是燃料、醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要原料[10-13]。研究玉米中的半胱氨酸蛋白酶具有重要的實(shí)際意義。玉米半胱氨酸蛋白酶(zmCP1)屬于C1家族，常以酶源的形式存在并以外切酶為主。其中10～26 個氨基酸殘基組成的酶前體，結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，通過分子內(nèi)或分子間蛋白水解而激活，其它C1家族半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶、獼猴桃素、組織蛋白酶B)盡管與zmCP1的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)具有很高的同源性，但在酶學(xué)性質(zhì)上有很大差別[2]。本文利用重組畢赤酵母菌株GS115-zmCP1表達(dá)zmCP1并利用響應(yīng)面法分析pH值，MgCl2濃度，溫度三個因素對zmCP1活力的影響，為深入研究zmCP1的酶學(xué)性質(zhì)提供依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與試劑

重組畢赤酵母菌株GS115-zmCP1由實(shí)驗(yàn)室保存；MgCl2、生物素、酵母氮源YNB、咪唑購自鼎國公司；酵母浸粉、蛋白胨購自Sigma公司；R-AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)、AMC購自上海生工；BCA蛋白測定試劑盒購自TaKaRa公司；組氨酸抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體購自QIAGEN公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重組畢赤酵母菌株GS115-zmCP1的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性轉(zhuǎn)化子于BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，250 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=2～6；3000 g 4 ℃離心5 min收集菌體并用 25 mL BMMY培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h補(bǔ)加100%甲醇至甲醇終濃度為0.5%，發(fā)酵96 h后離心收集上清，以GS-pPICZα-A和不加甲醇誘導(dǎo)的GS115-zmCP1作為陰性對照[14-15]。

1.2.2發(fā)酵產(chǎn)物SDS-PAGE與Western-Blot分析

取1 mL96 h發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，上樣量20 μL。用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，以1:1000稀釋的Penta-His Antibody作為一抗，1:1000稀釋的HRP-Goat Anti-Mouse IgG為二抗進(jìn)行Western-Blot分析鑒定。

1.2.3重組蛋白zmCP1的純化

將96 h的發(fā)酵液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，再經(jīng)超濾管(蛋白分子截留量：10 kD)進(jìn)行濃縮，測酶活。用鎳柱進(jìn)行純化。純化前，讓鎳柱中的20%乙醇自然流出，用5個柱體積的蒸餾水清洗，然后用5個柱體積的Binding buffer(20 mM磷酸鈉緩沖液，500 mM氯化鈉，20 mM咪唑，pH 7.4)進(jìn)行平衡，上樣，用10個柱體積的Binding buffer洗去雜蛋白，再用5個柱體積的Elution buffer(20 mM磷酸鈉緩沖液，500 mM氯化鈉，500 mM咪唑，pH 7.4)洗脫目的蛋白，收集量1 mL。對洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3zmCP1酶活的測定

1.3.1制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取適量AMC于100%DMSO中， 用Tris-HCl(pH 8.0、50 mmol)緩沖液配成不同濃度的200 μL AMC溶液，在激發(fā)波長380 nm、發(fā)射波長460 nm、狹縫寬5 nm條件下測定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，AMC摩爾濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[16-17]。

1.3.2樣品測定

參照文獻(xiàn)[16-17]檢測zmCP1酶活。反應(yīng)體系為200 μL：5 μL酶液，10 μL底物(100 mmol/L，20%DMSO)，185 μL Tris-HCl(pH 8.0、50 mmol)。反應(yīng)液50 ℃水浴30 min 后冰浴60 min，檢測熒光活力。激發(fā)波長380 nm、發(fā)射波長460 nm、狹縫寬5 nm/1.5 nm。酶活單位為U，1 U定義為每分鐘催化生成1 μmol AMC所需要的酶量。比活力=總活力(U)/總蛋白(mg)。蛋白含量用BCA 蛋白測定試劑盒測定。

1.4單因素試驗(yàn)

選取MgCl2濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10 mM)、反應(yīng)溫度(35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃)、pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。固定值分別為，MgCl2濃度：4.0 mM，反應(yīng)溫度：50 ℃，pH值：5.5；以R-AMC為底物按照上述酶活測定方法測定，以純化的zmCP1酶活為100%，相對酶活為縱坐標(biāo)，不同單因素為橫坐標(biāo)，探究各因素對zmCP1酶活的影響。

1.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以相對酶活作為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析，采用Box-Benhnken 法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平設(shè)計表，見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1zmCP1的表達(dá)鑒定及純化

GS115-zmCP1重組菌經(jīng)過96 h甲醇誘導(dǎo)，以GS-pPICZ-A和不加甲醇誘導(dǎo)的GS115-zmCP1為對照。SDS-PAGE分析結(jié)果見圖1。

圖1　發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白電泳圖和Western Blotting 鑒定

由圖1可知：在甲醇誘導(dǎo)后，GS115-zmCP1能特異性表達(dá)分子量約為34 kDa的蛋白，與理論分子量一致，Western-Blot鑒定的結(jié)果與SDS-PAGE分析結(jié)果相一致，表明zmCP1在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)。純化后zmCP1的比活力為209.32 U/mg。以純化后的酶活力為100%，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1pH對zmCP1活性的影響

pH對zmCP1活性的影響如圖4所示：高、低pH值和對酶活力都有抑制作用，在pH值從3.5逐漸增大的過程中，酶活力迅速上升，在6.0處達(dá)到最高點(diǎn)，之后酶活力下降相對緩和。因此選擇pH值6.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2　pH對zmCP1活性的影響

2.2.2反應(yīng)溫度對zmCP1活性的影響

反應(yīng)溫度對zmCP1活性的影響如圖3所示：zmCP1溫度適應(yīng)范圍很寬，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶活力呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢，在80 ℃時依然具有70%左右的活性，55 ℃的時候達(dá)到最大值，因此選擇反應(yīng)溫度55 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3　反應(yīng)溫度對zmCP1活性的影響

2.2.3MgCl2濃度對zmCP1活性的影響

MgCl2濃度對zmCP1活性的影響如圖4所示：隨著MgCl2濃度的增大，酶活力逐漸上升，在6 mM時，酶活力達(dá)到最大值，但是在超過6 Mm后，酶活力就呈現(xiàn)出抑制作用。因此選擇MgCl2濃度6 mM進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4　MgCl2濃度對zmCP1活性的影響

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面分析設(shè)計及結(jié)果

用Box-Benhnken法，以zmCP1相對酶活力為響應(yīng)值，MgCl2濃度、溫度、pH為自變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案與結(jié)果

使用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，結(jié)果分析表明，zmCP1酶活力大小與pH、溫度、MgCl2濃度之間為Quadratic模型關(guān)系，方程為：

zmCP1酶活力=166.42-1.91A+2.16B+1.80C+2.67AC-2.90BC-9.00A2-5.38B2-6.28C2

從方程中一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小可看出各影響因素對響應(yīng)值的影響程度為：B(溫度)>A(pH)>C(MgCl2濃度)。

表3　響應(yīng)面模型方差分析

注：P<0.01為極顯著，表示為**；P<0.05為顯著，表示為*。

2.3.2模型響應(yīng)面分析

圖5～圖7為由回歸方程建立的響應(yīng)面3D圖，反應(yīng)了pH、溫度、MgCl2濃度對響應(yīng)值zmCP1酶活的影響。曲線坡度的陡峭程度能夠反映出隨著影響因素的變化而導(dǎo)致的響應(yīng)值的變化趨勢；等高線形狀反應(yīng)出兩個交互作用是否顯著，偏橢圓則顯著，偏圓形則不顯著[18]。

圖5　Y=f(A,B)的響應(yīng)面圖和等高線

由圖5可知響應(yīng)面曲線相對趨于平緩，pH和溫度的交互作用對酶活性影響不大，且等高線的形狀偏圓形，說明pH和溫度兩因素的交互作用不夠顯著。

圖6　Y=f(A,C)的響應(yīng)面圖和等高線

由圖6可知響應(yīng)面曲線相對陡峭，說明pH和MgCl2濃度的交互作用對酶活性影響較大，且等高線形狀偏橢圓形，說明pH和MgCl2兩因素的交互作用顯著。

圖7　Y=f(B,C)的響應(yīng)面圖和等高線

由圖7可知響應(yīng)面曲線雖不及圖6響應(yīng)面曲線陡峭，但是從等高線形狀偏橢圓形能夠看出溫度和MgCl2濃度兩因素的交互作用顯著。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert分析響應(yīng)面試驗(yàn)得出的zmCP1酶活最佳參數(shù)為pH 5.95，溫度55.89 ℃，MgCl2濃度6.08 mM；預(yù)測相對酶活力為166.78%。由于實(shí)際操作原因，將參數(shù)修改為pH6.0，溫度56 ℃，MgCl2濃度6.0 mM。在上述參數(shù)條件下進(jìn)行三組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的zmCP1相對酶活為167.13%，預(yù)測值與實(shí)測值相差不大，說明數(shù)學(xué)模型的合理性較高；響應(yīng)面法分析各因素對zmCP1酶活力影響較可靠，有參考價值。

3　結(jié)　論

本文利用畢赤酵母進(jìn)行真核表達(dá)，使得表達(dá)出的zmCP1具有天然活[19-20]并且通過 Box-Behnken 的中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立zmCP1相對酶活力的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，驗(yàn)證表明該模型合理，可很好地預(yù)測zmCP1在pH，溫度，MgCl2濃度交互作用影響下的相對酶活。軟件分析結(jié)合實(shí)際操作情況得到的zmCP1酶活的最佳參數(shù)為pH 5.95溫度56 ℃，MgCl2濃度6.08 mM。相應(yīng)的zmCP1相對酶活達(dá)到166.78%。驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果(167.13%)與預(yù)測值基本吻合，說明該模型可靠，將該模型結(jié)合zmCP1較寬的溫度和pH適應(yīng)范圍，能夠較為精準(zhǔn)的指導(dǎo)該酶在實(shí)際生產(chǎn)中的運(yùn)用。

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Analysis of Influences of Different Factors onZeaMaysCysteine Proteases Using Response Surface Methodology (RSM)*

CHENFang-qi1,2,LIUHui-min2,3,ZHENGMing-zhu1,2,JINSong1,LIUJing-sheng1,2

(1 College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118;2 National Engineering Laboratory of Wheat and Corn Deep Processing, Jilin Agricultural University,Jilin Changchun 130118;3 College of Life Science, Jilin University, Jilin Changchun 130023, China)

ZeamaysCysteine Protease is a kind of significant proteolytic enzymes, in order to study the enzymology properties of zmCP1, the zmCP1 was expressed by using the recombinant P. pastoris and the influences of different factors (pH, temperature, concentration of MgCl2) on the activity of zmCP1 were analyzed by RSM with the relative enzyme activity of zmCP1 acted as response value. The results showed that when the three factors was pH 5.95，55.89 ℃，6.08 mM MgCl2，respectively, the predicted relative enzyme activity was 166.78%, measured value was 167.13%. The model is reasonable and has reference value.

zmCP1; fermentation; RSM; enzyme activity

國家自然科學(xué)基金(31171760)；公益性行業(yè)(糧食)科技專項(xiàng)基金(201313011-3)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動基金。

陳方奇(1991-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)工程與功能性食品的研究。

劉景圣(1964-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食深加工與功能性食品。

Q786

A

1001-9677(2016)010-0043-05