吳松濤，段雪云

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北　武漢　430065；2 湖北省中醫(yī)院，湖北　武漢　430061)

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內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測定氨薄荷酊中薄荷腦含量的比較

吳松濤1，段雪云2

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065；2 湖北省中醫(yī)院，湖北武漢430061)

為了對氨薄荷酊測量薄荷腦含量，用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法對所得結(jié)果進(jìn)行比較，并改進(jìn)原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。用自動進(jìn)樣氣相色譜對氨薄荷酊進(jìn)行測定，通過內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法可得氨薄荷酊中待測物含量。內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法薄荷腦含量測定結(jié)果有顯著性差異,在準(zhǔn)確度和精密度上內(nèi)標(biāo)法優(yōu)于外標(biāo)法。實驗人員根據(jù)實驗條件，應(yīng)盡量選擇內(nèi)標(biāo)法。

氨薄荷酊；薄荷腦；氣相色譜法；內(nèi)標(biāo)法；外標(biāo)法

氨薄荷酊為湖北省中醫(yī)院自制制劑，具有清熱解毒，涼血止痛、止癢的功能，臨床上用于蚊叮蟲咬等[1]。現(xiàn)行氨薄荷酊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的NH3的含量測定為化學(xué)測定法，實驗對氨薄荷酊的含量測定進(jìn)行研究以更好的控制該制劑質(zhì)量。薄荷腦的測定常用方法有外標(biāo)法[2]、內(nèi)標(biāo)法[3]、一測多評法[4]和歸一化法[5],但卻并未找到相關(guān)方法比較的文獻(xiàn)。為找到方便、準(zhǔn)確的測定方法，實驗對內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法進(jìn)行比較。

1　實　驗

1.1實驗材料

自動進(jìn)樣氣相色譜儀(PerkinElmerClarusGC580，氫火焰離子化檢測器FID)；電子分析天平(PrecisaES225SM-DR)；薄荷腦對照品(110728-2005506)；水楊酸甲酯對照品(110707-201413)；氨薄荷酊(自制)；氨水、無水乙醇為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件

固定相毛細(xì)管柱(交聯(lián)鍵合聚乙二醇)，30m×0.323mm×1.20μm；柱溫：120 ℃；柱流量：高純氮3.2mL/min(恒流) ；氣體流量：氫氣 45mL/min，空氣 450mL/min，F(xiàn)ID尾吹氣30mL/min。進(jìn)樣口：250 ℃；檢測器：250 ℃。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比10:1[6-8]。

1.2.2溶液的制備

(1)內(nèi)標(biāo)溶液：向10mL量瓶中精密加入水楊酸甲酯[9]對照品0.1068g，加無水乙醇至刻度，作為內(nèi)標(biāo)儲備液，向10mL容量瓶加入儲備液1mL，加無水乙醇至刻度，得濃度為1.068mg/mL的內(nèi)標(biāo)液。

(2)供試品溶液：向25mL容量瓶精密加入氨薄荷酊1mL(批號20140710)，稀釋得1mg/mL供試品儲備液。向10mL量瓶精密加入內(nèi)標(biāo)液和供試品儲備液2mL，加無水乙 醇至刻度，既得供試品溶液。

(3)對照品溶液：于50mL容量瓶精密加入薄荷腦24.1mg,加無水乙醇至刻度得0.482mg/mL的對照品溶液。

1.2.3專屬性試驗

按照供試品溶液的制備方法取薄荷以外的其余藥味，制得陰性對照溶液。如1.2.1所述設(shè)定色譜條件，發(fā)現(xiàn)在薄荷腦對照品相同保留時間處無干擾峰，可知薄荷含量腦測定不受其余藥味的干擾，見圖1。

圖1　HPLC色譜圖

1.2.4線性關(guān)系考察

向10mL量瓶精密加入薄荷腦對照品溶液(482.0μg·mL-1)1、3、5、7、9mL，再分別加入2mL內(nèi)標(biāo)液，加無水乙醇至刻度，得濃度為48.2、144.6、241、337.4、433.8μg·mL-1的對照品溶液。按上述色譜條件,精密吸取配制好的不同濃度的對照品溶液1μL，進(jìn)行測定。內(nèi)標(biāo)法：以薄荷腦與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為因變量,以藥物質(zhì)量(μg)為自變量進(jìn)行線性回歸，求得線性回歸方程。外標(biāo)法：以薄荷腦峰面積為因變量，以藥物質(zhì)量 (μg)為自變量進(jìn)行線性回歸，求得線性回歸方程。薄荷腦線性回歸方程為：(外標(biāo)法)y=0.7011x+4.7682，R2=0.9991(n=5)，(內(nèi)標(biāo)法)y=0.8899x+0.7546，R2=0.9995(n=5)，薄荷腦在0.0482～0.4338μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2　線性關(guān)系圖

1.2.5精密度試驗

精取薄荷腦對照品溶液(433.80μg·mL-1)，如1.2.1所述設(shè)定色譜條件，重復(fù)測定6次，進(jìn)樣量1μL。以測出的峰面積計算RSD值，可得內(nèi)標(biāo)法為0.63%，外標(biāo)法為0.86%，可知儀器精密度良好。

1.2.6穩(wěn)定性試驗

配制后的0、2、4、6、8、12、24h測定氨薄荷酊供試品溶液薄荷腦與內(nèi)標(biāo)物峰面積，進(jìn)樣量1μL。以測出的峰面積計算RSD, 可得內(nèi)標(biāo)法為0.18%，外標(biāo)法為1.14%，可知24h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

1.2.7重現(xiàn)性試驗

按1.2.1所述設(shè)定色譜條件，精取本品(批號20140710)樣品約1mL，共5份，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣量1μL，進(jìn)行測定。薄荷腦含量RSD，內(nèi)標(biāo)法為0.20%，外標(biāo)法為0.54%，表明方法重復(fù)性良好。

1.2.8加樣回收試驗

精取氨薄荷酊供試品溶液(含量為234.15μg·mL-1，批號20140610)4mL，共六份，加入薄荷腦對照品溶液(241.0μg·mL-1)2、4、6mL，進(jìn)樣量1μL,以測出的含量來計算回收率，結(jié)果見表1，得RSD值，外標(biāo)法為2.3，內(nèi)標(biāo)法為1.1。

表1　薄荷腦加樣回收率(n=6)Table 1　Recovery rate of menthol(n=6)

2　結(jié)果與討論

2.1樣品含量測定

依法精取6個不同批次的樣品制成供試品溶液，自動進(jìn)樣程序設(shè)定進(jìn)對照品溶液(433.8μg·mL-1和48.2μg·mL-1)1μL，供試品溶液1μL，如1.2.1所述設(shè)定色譜條件，每批樣品測2份，分別用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法計算薄荷腦含量，結(jié)果如表2所示。

表2　六批氨薄荷酊中薄荷的含量測定(n=6)Table 2　Content of mint elixirs in 6 batches of menthol(n=6)

續(xù)表2

20140710外標(biāo)法0.272820.295490.28438內(nèi)標(biāo)法0.246920.222260.2345920140720外標(biāo)法0.266850.289350.27810內(nèi)標(biāo)法0.245480.222820.2341520140810外標(biāo)法0.267120.291140.27913內(nèi)標(biāo)法0.246150.224110.2351320140820外標(biāo)法0.269330.291630.28048內(nèi)標(biāo)法0.246520.222520.23453

2.2兩種方法的比較及顯著性差異分析

對內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測得的薄荷腦含量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析(見表3)，表明內(nèi)標(biāo)法在準(zhǔn)確度和精密度兩方面強(qiáng)于外標(biāo)法。再對兩法對氨薄荷酊中薄荷腦含量測定數(shù)據(jù)進(jìn)行F,t檢驗，結(jié)果見表3。顯然，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測得的各組數(shù)據(jù)在水平α=0.05下,F值大于F0.05(5,5)=5.05,t值大于t0.05，10=51.07，這說明薄荷腦含量測定中兩種定量方法之間有顯著性差異，分析人員在條件允許下應(yīng)盡量選擇內(nèi)標(biāo)法。

表3　內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測定薄荷腦結(jié)果的分析Table 3　The analysis on determination of menthol with ISTD and ESTD

3　結(jié)　論

外標(biāo)法可靠標(biāo)準(zhǔn)工作曲線直接算出含量，適于分析大量樣品。但由于色譜條件很難保持一致，容易發(fā)生較大誤差。且用標(biāo)準(zhǔn)樣品來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對前處理中待測組分的變化沒有補(bǔ)償。

以內(nèi)標(biāo)物及待測組分的峰面積的比值為因變量的內(nèi)標(biāo)法， 系統(tǒng)誤差相對減少。待測組分在樣品前處理時的損失由于前處理前加入內(nèi)標(biāo)物，得到部分補(bǔ)償。操作程序較麻煩，有時尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難是內(nèi)標(biāo)法的缺點[10]。

本實驗經(jīng)對兩法的比較及顯著性差異分析，兩法分析薄荷醑中薄荷時應(yīng)首選內(nèi)標(biāo)法。

[1]湖北省衛(wèi)生廳.湖北省醫(yī)院制劑規(guī)范[M]. 武漢:武漢人民出版社,1999.

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Comparison Analysis on Determination of Menthol in Mint ElixirswithISTDandESTD

WU Song-tao1, DUAN Xue-yun2

(1 School of Pharmacy, Hubei University of Traditional Chinese medicine, Hubei Wuhan 430065;2 Hubei provincial Hospital of traditional Chinese medicine, Hubei Wuhan 430061, China)

TocomparewhethertheresultsofInternalStandardMethod(ISTD)andExternalStandardMethod(ESTD)determiningthementholconcentrationaresignificantdifferentandimprovethequalitystandard,makinguseofthegaschromatographtodetectmentholwithISTDandESTD.TheaccuracyandprecisionofISTDwerebetterthanonesofESTD,simultaneouslytherewasasignificantdifferenceinthequantitativeresultsofmentholwithISTDandESTD.TheanalyzersshouldchooseISTDbasedontheirexperimentalconditions.

mintelixirs;menthol;gaschromatography;ISTD;ESTD

吳松濤(1991-)，湖北中醫(yī)藥大學(xué)2014級研究生，研究方向：中藥新制劑、新劑型的研究。

段雪云(1966-)，主任藥師，研究方向：中藥新制劑、新劑型的研究。

R451

A

1001-9677(2016)013-0125-03