戴雅吉， 王　芳， 黃　鵬

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽　合肥　230012)

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磁性納米Fe3O4載新藤黃酸復合物的制備和表征*

戴雅吉， 王芳， 黃鵬

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽合肥230012)

采用化學共沉淀法制得Fe3O4磁性納米微粒，并用檸檬酸進行修飾，制備納米四氧化三鐵載新藤黃酸共軛復合物。利用TEM，XRD，IR對納米四氧化三鐵和檸檬酸修飾Fe3O4進行表征，磁性四氧化三鐵及其修飾物磁性良好，平均粒徑在15 nm左右，檸檬酸包裹后粒徑變大，但并未改變四氧化三鐵的晶型；并通過UV對納米四氧化三鐵載新藤黃酸復合物進行表征，結果表明磁性納米Fe3O4載新藤黃酸復合物制備成功。

納米磁性Fe3O4-新藤黃酸；制備；表征

藤黃是藤黃科植物藤黃(Garcinia hanbury i Hook. f.) 所分泌的干燥樹脂。藤黃具有攻毒蝕瘡、破血、散結等功效,中醫(yī)傳統(tǒng)用于消腫、化毒、止血等病。新藤黃酸為藤黃的有效成分之一，其抗瘤譜廣，且毒性較低，對于人非小細胞肺癌細胞A549、HCT-8、HeG2等腫瘤細胞具有較好的抑制作用[1-6]。由于新藤黃酸的水溶性差、刺激性大及生物利用度較低[7]，需要進一步研究加以改善。

近年來，關于磁性納米材料的研究報道很多。磁性納米材料具有納米材料所特有的性質, 其粒徑小,比表面積大,偶聯(lián)容量高,又具有超順磁性,可以在磁場下聚集和定位，特別是這類材料應用領域廣，可作為先進的磁性材料[8]、染料[9]和催化劑[10]等，另外在磁共振成像[11]和靶向載藥[12]方面也具有廣闊的應用前景。優(yōu)良的藥物載體應具有防止藥物局部濃度過高，減少藥物的損失及降解，降低其副作用，提高生物利用度，緩釋、控釋，靶向給藥等特點[13-16]磁性納米材料一方面具有較好的生物相容性，能吸附藥物到達病灶，保證局部給藥，降低了藥物的副作用，提高療效；另一方面藥物載體可以進行磁靶向給藥。基于磁性材料良好的生物相容性和磁靶向性，以檸檬酸修飾的Fe3O4磁性納米粒為核，在RPMI-1640培養(yǎng)液中，通過其活潑羧基與新藤黃酸以共價鍵結合，制備出磁性納米Fe3O4載新藤黃酸復合物，為提高新藤黃酸抗腫瘤的靶向性，降低刺激性和增加生物利用度提供新的思路和方法。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

新藤黃酸(純度>98%)，自制；RPMI-1640培養(yǎng)液、新生牛血清，Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.；六水合三氯化鐵，四水合二氯化鐵，氨水(25%)，檸檬酸，無水乙醇等均為分析純。

Nicolet NEXUS-870傅立葉紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；UV3600紫外分光光度計，日本島津公司；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡，日本電子；XD-3X射線衍射儀，北京普析通用儀器。

1.2實驗方法

1.2.1納米四氧化三鐵粒備

稱取1.05 g FeCl2·4H2O和2.61 g FeCl3·6H2O，在氮氣保護的條件下，100 mL蒸餾水超聲溶解配置成Fe3+：Fe2+約為1.75:1的溶液，溶液混合傾入三口燒瓶中緩慢攪拌20 min，同時逐漸加溫到80 ℃。緩慢滴加氨水10 mL，劇烈攪拌30 min，溶液逐漸變成黑色，停止攪拌后迅速利用磁分散技術，在外加磁場作用下將黑色Fe3O4納米粒子水洗數次，至pH顯中性，60 ℃真空干燥。

1.2.2檸檬酸修飾四氧化三鐵納米粒子

采用分散聚合法，1.25 g檸檬酸溶解到100 mL水溶液中，將1.2.1中制備的納米Fe3O4分散到該溶液中，攪拌，升溫至80 ℃，劇烈攪拌90 min，溶液由黑色逐漸變成淺灰色，停止攪拌后冷卻，超聲分散30 min，磁分離，蒸餾水洗至pH顯中性，所得物60 ℃真空干燥，稱重，得檸檬酸修飾Fe3O4。

1.2.3檸檬酸修飾納米Fe3O4載新藤黃酸復合物的制備

將新藤黃酸于二甲基亞砜中充分溶解，取2.7 mL RPMI-1640培養(yǎng)液，0.3 mL新生牛血清蛋白于錐形瓶中平行配置兩份，各加0.23 mg檸檬酸修飾Fe3O4，超聲溶解至底部無沉淀，其中一份加新藤黃酸0.15 mg，使?jié)舛葹?.05 mg/mL，超聲分散，4 °C低溫培養(yǎng)48 h，備用。

另精密稱取新藤黃酸4.00 mg溶解于18 mL RPMI-1640培養(yǎng)液，2 mL 新生牛血清蛋白的培養(yǎng)基中，配置成0.20 mg/mL新藤黃酸標準液，4 °C低溫培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.4納米Fe3O4-新藤黃酸含量測定

據文獻報道，新藤黃酸在300～500 nm有紫外吸收[17]。目前測定新藤黃酸含量的方法主要是HPLC，但其前處理比較繁瑣，因此采用UV測定納米磁性Fe3O4-新藤黃酸中新藤黃酸的含量。

分別取上述配置的新藤黃酸藥物0.005 mL，0.50 mL，1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL，5.00 mL，6.00 mL，7.00 mL稀釋到10 mL容量瓶中，配成濃度為0.001 mg/mL， 0.01 mg/mL，0.02 mg/mL，0.04 mg/mL，0.06 mg/mL，0.08 mg/mL，0.1 mg/mL，0.12 mg/mL，0.14 mg/mL的溶液，超聲分散，于300 nm～700 nm波長測范圍內測紫外，選擇新藤黃酸的檢測波長，依次在最大波長處測上述不同濃度的標準液，得圖譜(見圖5)。

采用低溫超速離心法，將1.2.3中配置的納米磁性Fe3O4-新藤黃酸10000 r/min離心1 h。除去游離的新藤黃酸藥物，下層固體用3 mL培養(yǎng)液溶解，超聲分散，于300 nm～700 nm波長處測檸檬酸包裹的納米粒和載藥納米粒子的紫外吸光度(見圖6)。

2　結果與討論

2.1納米Fe3O4和納米Fe3O4-檸檬酸的磁性分析

由圖1A、B可見磁性納米Fe3O4和檸檬酸修飾Fe3O4納米粒加上外加磁場后，溶液中的磁性納米粒子吸附到磁場一端，溶液恢復澄清，證明產物有磁性。

圖1　納米四氧化三鐵(A)和納米四氧化三鐵-檸檬酸(B)

2.2納米Fe3O4和納米Fe3O4-檸檬酸納米粒TEM形貌分析

制備的MNP和檸檬酸修飾后的納米粒的TEM圖譜如圖2(A,B)所示，圖2顯示在80 ℃得到的納米粒徑較窄，約為15 nm，從形貌來看呈球形，但由于納米粒子之間存在庫侖力、范德華力等相互作用的靜電力，納米粒子外觀上表現出團聚現象，粒子分散性有待提高，粒子之間的團聚主要出現在樣品的干燥過程之中，由于納米粒子的小尺寸效應，粒子的表面能很大，粒子之間通過相互作用達到穩(wěn)定狀態(tài)，從而出現團聚現象。圖2B為納米Fe3O4-檸檬酸，在水溶液中Fe3O4納米粒子表面包裹檸檬酸后，磁性粒子之間直接接觸的機會減少，隨粒子尺寸變大平均15 nm，表面能減小，改善了粒子的團聚現象，增強了納米粒子的分散性。

圖2　納米四氧化三鐵(A)和納米Fe3O4-檸檬酸(B)的TEM照片

2.3納米Fe3O4和修飾后Fe3O4納米粒XRD分析

圖3為納米Fe3O4和檸檬酸修飾后Fe3O4納米粒的XRD圖譜，圖3A在2θ=30.2°，35.6°，43.2°，53.7°，57.2°，62.9°出現特征的衍射峰，此峰位與Fe3O4標準卡片JCPDS 79-0417很好地吻合，只是在強度上有所不同，表明納米結構主要是四氧化三鐵，其衍射峰分別屬于Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(422)，(333)，(440)得晶體形狀及對應結構。圖3B顯示相同的衍射峰，說明檸檬酸修飾Fe3O4-MNP并沒有改變納米粒子的晶型。修飾前后的Fe3O4的XRD譜峰位相對噪音較大，可能形成的晶型不是太規(guī)則。根據圖表數據由Scherrer公式β=kλ/Dcosθ，式中λ為X射線波長，k為峰形因子，D為晶體的平均粒徑，θ為Bragg衍射角，β為半峰寬。由此可以計算出復合粒子的平均粒徑。取衍射峰2θ=35.1°，k=0.89來計算，復合粒子的平均粒徑在15 nm左右，這與透射電鏡下所測得的結果基本相一致。

圖3　納米 納米Fe3O4(A)和X納米Fe3O4-檸檬酸(B)的XRD

2.4納米Fe3O4和修飾后Fe3O4納米粒IR圖譜分析

圖4　納米Fe3O4-檸檬酸(A)和磁性納米Fe3O4(B)的IR圖

納米Fe3O4和修飾后Fe3O4納米粒IR圖譜如圖4，圖4中由于-OH的伸縮振動在3417 cm-1附近有譜帶，其彎曲振動的譜帶在1618 cm-1附近，544 cm-1附近對應的是Fe-O-Fe的伸縮振動。而圖5的1619 cm-1，1434 cm-1，665 cm-1，641 cm-1，632 cm-1分別對應于圖4的1588cm-1，1393 cm-1，660 cm-1，645 cm-1，633 cm-1的峰，3370 cm-1，3186 cm-1峰有交叉，且峰型較寬，3370 cm-1對應的是檸檬酸的羥基氫與Fe3O4的氧原子締合成的氫鍵，3186 cm-1對應于-CH2-伸縮振動，這些都說明檸檬酸以非共價健與Fe3O4牢固結合，將Fe3O4納米粒包裹，形成表面含羥基等親水性基團。

2.5載藥納米粒UV圖譜分析

圖5　不同濃度新藤黃酸UV圖譜

由圖5可見411 nm有最大吸收波峰，而且此處無干擾，選擇411 nm作為檢測波長，分別測各標準液的吸光度A值為 0.342、0.55、0.826、1.276、1.626、2.103 。以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為: A=19.909c+0.0787, r=0. 9968，相關性良好。結果表明在10～100 μg/mL濃度范圍內，新藤黃酸的濃度與峰面積呈較好的線性關系。

圖6　納米Fe3O4-檸檬酸(A)載新藤黃酸后的納米四氧化三鐵(B、C)的UV圖譜

圖6中A為納米Fe3O4-檸檬酸UV圖，B、C為低溫離心法稀釋的載新藤黃酸納米Fe3O4-檸檬酸UV圖。由圖6可見A、B、C區(qū)別在于，B、C在411 nm處有吸收，而A曲線未出現，其余峰一致，說明藥物通過非共價鍵與檸檬酸修飾的四氧化三鐵結合牢固。

3　結　論

利用共沉淀法較為簡單快速的合成了磁性四氧化三鐵納米粒子，平均粒徑在10 nm左右，檸檬酸包裹厚度約5 nm，修飾后平均粒徑為15 nm，粒子粒徑和水溶性均增加，分子間引力減小，粒子分散性提高，且形貌并未改變，呈球形。通過紫外光譜法測定納米磁性Fe3O4載新藤黃酸復合物的含量，發(fā)現新藤黃酸可以以分子間引力與磁性Fe3O4納米粒結合，一定程度上解決新藤黃酸藥物水溶性差、生物利用度低的問題，同時也為提高水不溶性抗腫瘤藥物的靶向性、增強藥物水溶性提供新的思路和方法。

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Preparation and Characterization of Magnetic Nano Fe3O4Load Neogambogic Acid*

DAIYa-ji,WANGFang,HUANGPeng

(College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230012, China)

Fe3O4magnetic nanoparticles were prepared by chemical coprecipitation method, and nanoparticles were modified Neo-gambogic acid to prepare ferroferric oxide nano-neo gambogic acid conjugate complex. Fe3O4and citric acid modified Fe3O4were characterized by TEM, XRD and IR. Magnetic ferroferric oxide and its modification of magnetic were good, with an average size of about 15 nm, the size of the citric acid was increased after the inclusion of the citric acid, but did not change the crystal type of magnetite. The Fe3O4nanoparticles loading of neogambogic acid complexes were characterized by UV. The results showed that preparing the magnetic nanoparticles of Fe3O4loaded neo gambogic acid compound was successful.

neo-gambogic acid-loaded magnetic Fe3O4nanoparticles; preparation; characterization

安徽省教育廳自然科學研究項目(項目編號：KJ2014A134)。

戴雅吉(1992-)，女，碩士研究生。

黃鵬(1977-)，男，副教授，主要從事藥學的教學與科研工作。

Q946

A

1001-9677(2016)02-0071-04