鄭嫵媚， 初海平， 王　燕， 王福文△

(1. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所， 2. 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 濟(jì)南 250062)

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力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化*

鄭嫵媚1,2， 初海平1， 王燕1， 王福文1△

(1. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所， 2. 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 濟(jì)南 250062)

目的：觀察急性力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織p38絲裂原蛋白激酶(p38MAPK)的磷酸化程度、核因子 (NF-kB)和環(huán)氧合酶-2(COX-2) 的動(dòng)態(tài)變化，探討其對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)損傷心肌組織的作用。方法：雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分為對(duì)照組和力竭運(yùn)動(dòng)組，力竭運(yùn)動(dòng)組再分為運(yùn)動(dòng)后0 h組、3 h組、6 h組、12 h組、24 h組5個(gè)亞組(n=10)。通過一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)建立心肌損傷模型，分別于運(yùn)動(dòng)結(jié)束后不同時(shí)間點(diǎn)取大鼠左心室心肌組織，Western blot法檢測p-p38MAPK、NF-kB、COX-2蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織中p-p38MAPK均顯著增加(P<0.01)，且3 h組最高(P<0.01)； 運(yùn)動(dòng)后0 h，大鼠心肌組織中NF-kB和COX-2含量均無明顯改變，其余時(shí)間點(diǎn)二者均明顯增加(P<0.05)，NF-kB 含量6 h組顯著高于其它各組(P<0.05)，COX-2含量24 h組顯著高于其它各組(P<0.05)。結(jié)論：一次性急性力竭運(yùn)動(dòng)可以激活p38MAPK信號(hào)通路，從而活化NF-kB，并上調(diào)COX-2表達(dá)，引發(fā)過度炎癥反應(yīng)，提示p-p38MAPK、NF-kB和COX-2在急性力竭運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心肌損傷的過程中可能起著重要作用。

力竭運(yùn)動(dòng)；p-p38MAPK；NF-kB；COX-2；大鼠；心肌細(xì)胞

隨著競技體育比賽的日益激烈，過度運(yùn)動(dòng)所致的運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的發(fā)生日益顯著，正成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的嚴(yán)重問題之一。其病理發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，涉及眾多因素，但過度的炎性反應(yīng)是其產(chǎn)生的重要機(jī)制之一。環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase-2,COX-2)又稱為炎癥誘導(dǎo)酶，是影響體內(nèi)花生四烯酸代謝中最主要的前列腺素合成限速酶。文獻(xiàn)報(bào)道通過降低COX-2 mRNA表達(dá)，能減少患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。新型的COX-2抑制劑莫比可高選擇性的抑制COX-2，能很好地減緩急性運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷性炎癥[2]。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKS)是生物體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，在機(jī)體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中起著非常重要的調(diào)節(jié)和控治的作用。核因子-kB(nuclear factor kappa B, NF-kB)是在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，活化的NF-kB可以調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)因子如趨化因子、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子等基因的轉(zhuǎn)錄。 目前，關(guān)于力竭性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心肌損傷過程中p-p38MAPK、NF-kB和COX-2的動(dòng)態(tài)研究少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠負(fù)重力竭游泳運(yùn)動(dòng)建立心肌損傷動(dòng)物模型，觀察大鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變，并探討它們?cè)谶\(yùn)動(dòng)性心肌損傷產(chǎn)生中的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

p-p38MAPK兔單克隆抗體(美國Cell Signaling, #4511)，NF-kB兔單克隆抗體(美國Cell Signaling, #8242)，COX-2兔單克隆抗體(美國Cell Signaling, #12282)。J-25型高速冷凍離心機(jī)，美國 BLCKMEN公司；Victor1420多功能標(biāo)記儀，美國PERKIN ELMER公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；LAS4000型化學(xué)發(fā)光成像儀，日本FUJIFLM公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠60只，體重220～250 g，SPF級(jí)，購買于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20130001。實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫維持在20℃～26℃，保持相對(duì)濕度40%～70%，自由飲水。動(dòng)物室安靜、通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，由濟(jì)南康大飼料有限公司生產(chǎn)，許可證號(hào)：SCXK(魯)20130017。

1.3運(yùn)動(dòng)性心肌損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立

按照王福文等[3]的方法、條件和標(biāo)準(zhǔn)建立一次性大鼠力竭模型。大鼠尾部負(fù)2%體重的負(fù)荷進(jìn)行力竭游泳，游泳時(shí)間不能少于3 h。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

健康雄性Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，根據(jù)體重隨機(jī)分為安靜對(duì)照組和力竭運(yùn)動(dòng)組，后者又分為力竭運(yùn)動(dòng)后0 h組、3 h組、6 h組、12 h組、24 h組(n=10)。安靜對(duì)照組大鼠不做任何運(yùn)動(dòng)，力竭性運(yùn)動(dòng)組按照建模要求運(yùn)動(dòng)。

1.5動(dòng)物取材

大鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h，分別腹腔注射20%烏拉坦(0.2 ml/100 g)麻醉，放血后迅速取下心臟，在左心室同一部位取心肌組織200～250 mg，裝入EP管中，置于-80℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1Western blot法檢測心肌組織中p-p38MAPK、NF-kB、COX-2 的表達(dá)取液氮保存的心臟組織100 mg，在研缽中加入液氮研磨，然后加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1 ml研磨均勻，倒入玻璃勻漿器中充分裂解，設(shè)置高速低溫離心機(jī)的條件為14 000 r/min、4℃，離心10 min，取上清液，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩CA試劑盒測定勻漿上清液的蛋白濃度，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，10%分離膠，5%濃縮膠，p-p38 一抗(1∶1 000)、NF-kB(p50)一抗(1∶1 000)和COX-2 一抗(1∶500)，化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯影后，應(yīng)用Image J圖像處理系統(tǒng)處理蛋白條帶，進(jìn)行半定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組心肌組織中p-p38MAPK表達(dá)

與安靜對(duì)照組比較，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間0 h組、3 h組、6 h組、12 h組、24 h組 心肌組織中p-p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，且3 h組最高，隨后明顯降低(P<0.01，圖1, 表1)。

Tab. 1　Effect of acute exhausted exercise on p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 in rats-relative ±s， n=10)

p-p38MAPK：p-p38 mitogen-activated protein kinase； NF-kB：Nuclear factor kappa B; COX-2: Cycloxygenase-2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,##P<0.01vs0 h group;?△P<0.05,△△P<0.01vs3 h group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vs6 h group;?○P<0.05vs12 h group

Fig. 1Dynamic change of myocardium p-p38MAPK in different time periods after single bout exhausted exercise in rats

2.2心肌組織中NF-kB表達(dá)

與安靜對(duì)照組比較，力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠運(yùn)動(dòng)后3 h組、6 h組、12 h組和24 h組 心肌組織中NF-kB蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；運(yùn)動(dòng)后0 h組、3 h組和6 h 組NF-kB表達(dá)逐次遞增，且6 h組為最高(P<0.01)，隨后逐漸降低(P<0.01,表1, 圖2)

2.3心肌組織中COX-2表達(dá)

與安靜對(duì)照組比較，力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠運(yùn)動(dòng)后3 h組、6 h組、12 h組和24 h 組心肌組織中COX-2蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，運(yùn)動(dòng)后0 h組、3 h組、6 h組 COX-2蛋白表達(dá)逐次遞增， 6 h組顯著高于運(yùn)動(dòng)后0 h組和 3 h組(P<0.05)，12 h組有所降低， 24 h組達(dá)高峰(P<0.05，P<0.01，表1，圖2)

Fig. 2Dynamic change of myocardium NF-kB and COX-2 in different time periods after single bout exhausted exercise in rats

NF-kB：Nuclear factor kappa B; COX-2: Cycloxygenase-2

3　討論

適度運(yùn)動(dòng)可以有效地改善心血管功能，而過度運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激性刺激，會(huì)導(dǎo)致心臟功能不全、超微結(jié)構(gòu)損傷、電生理異常等。因此由過度運(yùn)動(dòng)尤其是力竭運(yùn)動(dòng)或長時(shí)間的劇烈運(yùn)動(dòng)所引起的心肌損害逐漸成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。有研究表明，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)中由于心肌缺血缺氧可致心肌產(chǎn)生一定的損傷，隨后由于血液供應(yīng)的恢復(fù)，可致心肌產(chǎn)生比運(yùn)動(dòng)時(shí)更嚴(yán)重的損傷，這與臨床缺血再灌注損傷相似，因此又稱之為運(yùn)動(dòng)性缺血再灌注損傷[4]。王福文等[3]研究表明，力竭性運(yùn)動(dòng)不僅可以產(chǎn)生直接的心肌損傷，也可以引起運(yùn)動(dòng)延遲性心肌損傷。

眾所周知，炎癥是由炎癥介質(zhì)如花生四烯酸等引起的，機(jī)體受到局部損傷或刺激后，在環(huán)氧合酶作用下花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，引起炎癥。COX又名前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶，有COX-1和COX-2兩種亞型，結(jié)構(gòu)酶COX-1在正常生理狀態(tài)下持續(xù)表達(dá)，對(duì)炎癥介質(zhì)的增加沒有影響；COX-2為誘生性酶，其表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)外各種刺激因素調(diào)節(jié)，與炎癥、疼痛等有密切關(guān)系，可通過催化花生四烯酸促進(jìn)炎性前列腺素物質(zhì)合成，引起炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)炎性細(xì)胞毒性。抑制COX-2表達(dá)，可減輕心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌缺血再灌注損傷[5]。

COX-2的表達(dá)受多個(gè)程序調(diào)控，其一可通過p38MAPK信號(hào)通路上調(diào)COX-2的表達(dá)。p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最近研究較多的一種調(diào)控炎癥機(jī)制的信號(hào)通路，磷酸化的p38MAPK是p38MAPK信號(hào)通路中介導(dǎo)炎性反應(yīng)的活性物質(zhì)。研究已證實(shí)，p38MAPK抑制劑SB203580可明顯降低炎癥因子的產(chǎn)生，從而減少炎癥反應(yīng)[6]。COX-2啟動(dòng)子的活性可通過p38MAPK特異性抑制劑顯著下調(diào)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間心肌組織中p-p38MAPK表達(dá)均顯著增加，且3 h p38MAPK磷酸化程度最高，說明力竭性運(yùn)動(dòng)可以激活起p38MAPK信號(hào)通路。其二是通過NF-kB信號(hào)通路對(duì)COX-2起調(diào)控作用。NF-kB是對(duì)缺氧敏感的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，它可以調(diào)節(jié)超過60個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)如細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子等，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程。

臨床研究表明，NF-kB在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用，NF-kB p65可誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，誘導(dǎo)和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，在心肌缺血再灌注過程中發(fā)揮重要作用[8]。p38MAPK信號(hào)通路和NF-kB信號(hào)通路具有相關(guān)性，活化的p38MAPK進(jìn)入細(xì)胞核，激活NF-kB，下調(diào)p38MAPK信號(hào)通路可抑制NF-kB的過度激活[9]。p38MAPK在調(diào)節(jié)激活子蛋白-1(transcription activitor 1，AP-1)的活性中起著重要作用，而AP-1是調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，抑制NF-kB和AP-1的活性可以控制COX-2的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，力竭性運(yùn)動(dòng)后3 h p38MAPK磷酸化程度最高，6 h NF-kB達(dá)到高峰，滯后于p38MAPK的表達(dá)，24 h COX-2達(dá)到高峰，滯后于p38MAPK、NF-kB的表達(dá)，p38MAPK、NF-kB與COX-2在表達(dá)強(qiáng)度上有時(shí)相上的先后性。p38MAPK通路可以通過多種間接方式調(diào)節(jié)NF-kB的活化，p38MAPK和NF-kB可能共同參與了COX-2的發(fā)生、發(fā)展過程。說明在力竭運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心肌損傷的過程中，過度運(yùn)動(dòng)可能首先激活p38MAPK信號(hào)通路，使p38MAPK磷酸化，然后活化NF-kB，從而調(diào)控且促進(jìn)COX-2的表達(dá)，引發(fā)過度炎性反應(yīng)，造成運(yùn)動(dòng)性心肌損傷。因此p38MAPK可能是預(yù)防和治療運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的新靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，給予p38MAPK特異性抑制劑BIRB796后，p38MAPK表達(dá)明顯下降，心肌缺血再灌注損傷明顯減輕[11]。劉流[12]等人也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK的表達(dá)能減少炎性因子生成，抑制炎性反應(yīng)，從而減少心肌缺血再灌注損傷。

總之，一次性力竭運(yùn)動(dòng)可以引起心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2均出現(xiàn)不同程度的升高，且高峰期呈時(shí)間依賴式特點(diǎn)，提示p38MAPK信號(hào)通路、NF-kB 和COX-2皆介入了運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的形成過程。

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The dynamic expression changes of myocardium p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 in rats after an exhausted exercise

ZHENG Wu-mei1,2, CHU Hai-ping1, WANG Yan1, WANG Fu-wen1△

(1. Institute of Materia Medica, Shandong Academy of Medical Sciences, 2. School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan- Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China)

Objective: To observe the dynamic expression changes of p38 mitogen-activated protein kinase(p38MAPK), nucler facter kappa B (NF-κB) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in myocardial tissue after an exhausted exercise and study the impact of p38MAPK, NF-kB and COX-2 on its myocardial damage. Methods: Sixty Wister male rats were randomly divided into the control group (n=10) and the exhausted exercise group (n=50). Then the exhausted exercise group was further divided into 5 subgroups, namely 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h after an exhausted exercise(n=10). The myocardial injury animal model was set up by using an exhausted swimming exercise and the expression of p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 were examined by Western blot. Results: Compared with the control group, the expression of p-p38MAPK were increased significantly(P<0.01) in all the groups and the 3 h group was the highest(P<0.01); The expression of NF-kB were increased significantly(P<0.05) in all the groups but 0 h (P>0.05) and the 6h group was increased significantly compared with the other groups(P<0.05); The expression of COX-2 were increased significantly(P<0.05) in all the groups but 0 h and the 24 h groups was increased significantly compared with the other groups(P<0.05). Conclusion: p38MAPK was activated in an acute exhausted exercise, p-p38MAPK may play an important role in modulating NF-kB and COX-2 expression and mediating the exhausted exercise induced myocardial damage.

exhaustive exercise;p-p38MAPK;NF-kB;COX-2;rats;myocardial cell

國家科技重大專項(xiàng)子課題(2009ZX09301-013)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(ZR2009CM089)

2015-06-15

2015-10-12

△Tel: 0531-82919972； E-mail: wangfuwww@tom.com

R965.2

A

1000-6834(2016)01-088-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.023