趙彥華，劉洪巖，丁正峰，孫夢玲，薛暉（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇　南京　210017）

膠體金免疫層析技術(shù)在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

趙彥華，劉洪巖，丁正峰，孫夢玲，薛暉
（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京210017）

摘要：膠體金免疫層析技術(shù)作為一種新型的檢測技術(shù)，在實際應(yīng)用中具有簡單、快速、成本低廉等優(yōu)點，因而廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，本文就膠體金免疫層析技術(shù)的應(yīng)用原理以及在水產(chǎn)品藥物殘留的應(yīng)用進(jìn)展作簡要概述。

關(guān)鍵詞：膠體金免疫層析技術(shù)；水產(chǎn)品；藥物殘留檢測

近年來，隨著人們對食品質(zhì)量安全的重視以及貿(mào)易出口的需要，水產(chǎn)品中藥物殘留問題也越來越受人們的重視。大量抗菌藥物的使用，導(dǎo)致動物性食品中藥物殘留狀況較為嚴(yán)重，對人類的健康構(gòu)成了潛在的危害。然而常規(guī)的檢測方法對儀器設(shè)備、環(huán)境、操作技能等有很高的要求，而且具有檢測周期較長、價格昂貴等缺點，因此建立一種新型快速穩(wěn)定的檢測方法是十分必要的［1］。膠體金免疫層析技術(shù)是以固相膜為載體的一種新型的快速檢測技術(shù)，具有快速、簡單、成本低廉等優(yōu)點，因而自20世紀(jì)80年代發(fā)展至今，已經(jīng)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中得到了迅速廣泛的應(yīng)用［2］，本文針對膠體金免疫層析技術(shù)的原理以及在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中的應(yīng)用進(jìn)展做一簡要概述。

1　膠體金免疫層析技術(shù)的簡介

1.1膠體金免疫層析技術(shù)的原理

膠體金免疫層析技術(shù)（Gold immunochromatography assay GICA）是集金標(biāo)技術(shù)、檢測技術(shù)和層析技術(shù)于一體的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)?；A(chǔ)的晶核（原子金Au，由11個金原子形成的二十面體）和外層的雙離子層構(gòu)成膠體金粒子，而膠體金粒子則是構(gòu)成膠體金溶液的主要物質(zhì)。金顆粒在氯金酸（HAuCl4）還原劑的作用下形成顆粒狀，并且以一種疏水的膠狀形式存在，在金粒子表面存在著一層陰性電荷，膠體金顆粒互相排斥，在靜電作用下形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)從而使懸浮液保持穩(wěn)定［3］。膠體金粒子對蛋白質(zhì)具有很強的吸附性，可以與多種免疫球蛋白共價結(jié)合，并且在金顆粒聚集的地方肉眼可直接觀察到粉紅色斑點，因而可用于定性或半定量實驗。

膠體金免疫層析技術(shù)是以固相膜為載體的膠體金技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合起來的一項新的檢測技術(shù)，將已知的抗原或者抗體吸附于固相膜上，在固相膜的結(jié)合釋放墊上吸附膠體金顆粒標(biāo)記物，其兩端分別與樣品墊和固相膜相連；待檢樣品在毛細(xì)作用下會向前移動，當(dāng)移動到金標(biāo)顆粒標(biāo)記物處時，就能吸附上標(biāo)記物，繼續(xù)移動至相應(yīng)檢測線并出現(xiàn)肉眼可見的顏色變化，從而來判斷結(jié)果。

1.2膠體金粒子的特性

膠體金粒子具有兩大類特性。一類特性是具有很強的吸附作用，尤其是對蛋白質(zhì)，可以與多種免疫球蛋白、酶、牛血清白蛋白、葡萄球菌蛋白等多肽非共價結(jié)合，因而可以作為一種工具用于實驗室研究［4］。膠體金顆粒的表面吸附蛋白質(zhì)即膠體金標(biāo)記的過程，膠體金顆粒和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合過程主要是依靠一些疏水作用力、離子鍵或者是配位鍵來實現(xiàn)。其中疏水作用力主要是蛋白質(zhì)依靠疏水作用力吸附于金顆粒表面；離子鍵主要是正負(fù)電荷之間的反應(yīng)；配位鍵是氨基酸的硫殘基與金顆粒發(fā)生電子層配位［5］。

膠體金顆粒的另一個重要的特性就是在金標(biāo)蛋白結(jié)合處可以肉眼觀察到顏色變化，可以用于定性或者半定量的快速檢測中［6］。由于標(biāo)記物在相應(yīng)配體處大量聚集存在，因而金標(biāo)顆粒聚集處會出現(xiàn)粉色或者是紅色斑點，在顯微鏡下尤為明顯，可以觀察到黑褐色顆粒的存在。

1.3膠體金免疫層析技術(shù)反應(yīng)方法

膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性［7］。膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。常用的膠體金免疫層析技術(shù)反應(yīng)方法包括競爭法、捕獲法以及夾心法，根據(jù)檢測物質(zhì)的分子量大小來選用不同的技術(shù)反應(yīng)方法，從而達(dá)到最好的檢測效果。

1.3.1競爭法用于檢測小分子抗原，具有靈敏度高、反應(yīng)迅速、不易形成交叉反應(yīng)等特點。在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中主要應(yīng)用于喹諾酮類的檢測［8］。

1.3.2捕獲法捕獲法在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中的應(yīng)用較少，但是可應(yīng)用于魚類疾病的診斷，主要檢測病原微生物產(chǎn)生的特異性抗體，對于標(biāo)本較難采集的病原體，也可采用此方法檢測［9］。

1.3.3夾心法夾心法主要是用于檢測大分子抗原物質(zhì)，有雙抗原夾心法和雙抗體夾心法兩種方式。雙抗原夾心法主要用于檢測抗體，標(biāo)記和包被均采用抗原。雙抗體夾心法則主要用于檢測顆粒性大分子抗原物質(zhì)。

2　膠體金免疫層析技術(shù)在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中的優(yōu)勢

目前檢測水產(chǎn)品中的藥物殘留最常見的檢測方法是利用儀器進(jìn)行分析，主要是色譜法，包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）以及色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)等［10］。

氣相色譜法是定量測定氯霉素較為經(jīng)典的方法，也是我國商檢定量分析氯霉素殘留首選方法［11］。但氣相色譜法前處理過程復(fù)雜，衍生化過程較為繁瑣耗時，從而使得該方法具有一定的局限性。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)雖然具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是不適用于養(yǎng)殖用戶、生產(chǎn)加工企業(yè)及基層檢測單位的推廣應(yīng)用［12］。

相比傳統(tǒng)的檢測方法，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)檢測水產(chǎn)品中藥物殘留，具有以下優(yōu)勢：①樣品不必進(jìn)行處理，可直接檢測組織液或者血液。②不需要操作大型的儀器設(shè)備，大大簡便了操作，對實驗人員的技能要求較低，更適用于野外現(xiàn)場應(yīng)用。③試劑用量少，試紙條體積小，攜帶方便，無污染，可以用于大批量樣品的現(xiàn)場檢測。④準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，假陽性率較低，結(jié)果判斷簡單，能夠快速準(zhǔn)確的反應(yīng)樣品中藥物殘留的情況。⑤檢測時間較短，一般5～10 min就可以目測結(jié)果，并且檢測結(jié)果可以長期保存。

3　膠體金免疫層析技術(shù)在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中的應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)需要免疫學(xué)原理才可以檢測，這樣可以提高對藥物的識別性從而對組織細(xì)胞內(nèi)的微型藥物都有著非常高的敏感性［13］。膠體金免疫檢測技術(shù)具有迅速準(zhǔn)確的特點，因而其在水產(chǎn)品藥物殘留檢測上的應(yīng)用非常廣。國內(nèi)許多科研工作者已著手研究膠體金免疫層析法用于水產(chǎn)品中禁限用漁藥、激素、重金屬、微生物等快速檢測技術(shù)，為該技術(shù)的成果轉(zhuǎn)化做好科研儲備［14］。

目前，氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃類藥物在水產(chǎn)品中殘留最為嚴(yán)重，屬于必檢項目［15］。這些藥物簡單且廉價易得，因而在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用較廣，在動物體內(nèi)代謝時間較長，能夠不同程度的在水產(chǎn)品中蓄積，最后通過食物鏈的作用危害人體健康，主要表現(xiàn)為致癌、致畸、致突變等作用。社會各界研究者建立了諸多方法用于更簡便快捷的檢測這些藥物殘留，尤其以膠體金免疫層析技術(shù)在這些藥物殘留檢測中的研究進(jìn)展較多。

3.1膠體金免疫層析技術(shù)在氯霉素檢測中的應(yīng)用

氯霉素作為廣譜抗生素，在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防和治療中具有明顯的效果。但是氯霉素在水產(chǎn)品體內(nèi)有明顯的殘留現(xiàn)象，殘留期長，通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體產(chǎn)生嚴(yán)重危害［16］。因此，國內(nèi)外均制定了一系列的法律法規(guī)禁止氯霉素的使用，我國農(nóng)業(yè)部也規(guī)定在動物性食品中不得檢出氯霉素。

李余動等［17］在2005年建立了氯霉素膠體金免疫層析試紙條，檢測蝦肉樣品時，靈敏度可達(dá)到1 ng/mL，無交叉反應(yīng)。桑麗雅等［18］在2013年研制了氯霉素快速檢測膠體金試劑條，該試劑條對水產(chǎn)品中氯霉素的檢測限為0.3 μg/kg，假陽性率4%，假陰性率為2%，常溫保質(zhì)期在6個月以上。楊挺等［19］根據(jù)競爭式膠體金免疫層析試驗原理，研制了氯霉素檢測免疫試紙條，該金標(biāo)試紙條對蝦肉樣品中的氯霉素最低檢出限為1.5 μg/kg。王瑋［20］利用膠體金標(biāo)記快速檢測技術(shù)對氯霉素獸藥殘留快速檢測方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，建立了以氯霉素與固相膜上的氯霉素-卵清蛋白（CAP-OVA）偶聯(lián)物（即包被抗原）競爭結(jié)合金標(biāo)記抗氯霉素多克隆抗體的方法，利用膠體金顯色的特點最后達(dá)到快速檢測樣品中氯霉素殘留的目的。

3.2膠體金免疫層析技術(shù)在孔雀石綠檢測中的應(yīng)用

孔雀石綠屬于一種三苯甲烷類殺菌劑，具有高效和價格低廉的特點，因而在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中被廣泛應(yīng)用。然而孔雀石綠及其代謝物都具有高殘留性和高毒性，不僅僅造成了水產(chǎn)品的畸變和癌變，也給食用者的健康帶來了潛在的風(fēng)險［21］。

桑麗雅等［22］運用免疫膠體金快速層析技術(shù)對水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留進(jìn)行快速篩選，最低檢出限分別為l μg/kg和3 μg/kg，但是檢測時間較長，約為30 min。山珊等［23］基于競爭抑制反應(yīng)原理，制備出了孔雀石綠膠體金免疫層析試紙條，建立孔雀石綠免疫層析定量檢測方法，檢測靈敏度為3 μg/L。

3.3膠體金免疫層析技術(shù)在呋喃唑酮代謝物檢測中的應(yīng)用

硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝形成的代謝物，能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白結(jié)合物，該類結(jié)合物在弱酸條件下能夠分解并被人體吸收，對人體健康產(chǎn)生極大的影響。對中國漁業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成巨大影響之一的“多寶魚事件”便是因硝基呋喃代謝物殘留引起的。

2004年，Kevin等首先制備出了呋喃唑酮衍生物的多克隆抗體，為呋喃唑酮代謝物的免疫分析方法奠定了基礎(chǔ)。2013年劉歡等［24］基于免疫膠體金技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留快速檢測和評價系統(tǒng)。張敏、桑麗雅等［25］研制了用于檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的膠體金快速檢測試劑板，該試劑板為四合一試劑板，對水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃它酮代謝物和呋喃妥因代謝物的檢出限分別為 1.0、1.0、1.0、2.0 μg/kg。結(jié)果表明該試劑板具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點，適用于大批量水產(chǎn)樣品中硝基呋喃代謝物的檢測。

在中國，水產(chǎn)品養(yǎng)殖的模式主要以個體養(yǎng)殖為主，養(yǎng)殖戶多又分散，就造成了個別養(yǎng)殖戶在生產(chǎn)過程中使用違禁藥物。水產(chǎn)品質(zhì)量檢測是水產(chǎn)品質(zhì)量管理、衡量水產(chǎn)品質(zhì)量安全水平的首要手段，具有非常重要的現(xiàn)實意義［26］。近年來，隨著食品安全體系的健全和發(fā)展，面對多而散的龐大監(jiān)管對象，如何實現(xiàn)安全、快速、高效的檢測，成為食品檢測中的熱點問題。尤其針對中國水產(chǎn)品膠體金免疫層析技術(shù)作為一種新興技術(shù)，具有實驗室傳統(tǒng)檢測方法所不具有的優(yōu)勢，能夠縮短實驗室檢測時間、成本低廉、及時準(zhǔn)確并且可用于大批量的現(xiàn)場檢測等特點，從而在生物醫(yī)學(xué)、臨床檢測、微生物檢測以及藥物殘留檢測中有廣泛的應(yīng)用。

4　小結(jié)

目前，國內(nèi)許多科研工作者已著力研究膠體金免疫層析法在水產(chǎn)品藥物殘留中的應(yīng)用，使得這項技術(shù)的實際應(yīng)用價值更高。由于這項技術(shù)屬于新興技術(shù)，雖然許多生物技術(shù)公司也已經(jīng)開發(fā)了相應(yīng)的產(chǎn)品，但是成品化的產(chǎn)品有限，產(chǎn)品成果較少，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這項技術(shù)將會逐步成熟和完善，其在水產(chǎn)品檢測中具有很好的應(yīng)用前景。

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資助項目：江蘇省水產(chǎn)三項工程（D2013-52）

中圖分類號：Q176

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2091（2016）07-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.07.001

收稿日期：（2015-11-18）

作者簡介：趙彥華（1986-），女，研究實習(xí)員，主要從事水產(chǎn)病害研究.E-mail:njzhaoyanhua@163.com

通信作者：薛暉（1968-），男，碩士，研究員級高級工程師，主要從事水產(chǎn)病害研究.E-mail:jsxuehui@163.com

Colloidal Gold Immunochromatographic Assay（GICA）for detection of drug residues in aquatic products

Zhao Yanhua，Liu Hongyan，Ding Zhengfeng，Sun Mengling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Abstract：Colloidal Gold Immunochromatographic Assay（GICA）is a new detecting technology，and it is convenient，rapid and inexpensive.GICA has been widely studied and used in biology areas.Principle，applications as well as development prospect of GICA in detection of drug residues in aquatic products were summarized in this paper.

Key words：Colloidal Gold Immunochromatographic Assay（GICA）；aquatic product；drug reseidues detection