鮑昱辰 趙印敏 陳斌 羅潔 鄧沁芳 孫輝 謝博雄 周崧雯

肺癌的發(fā)病率和死亡率很高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1,2]。在我國(guó)城市中肺癌死亡率已上升為第一位[3]。隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，靶向藥已成為治療非小細(xì)胞肺癌的重要手段[4]。然而，即使對(duì)于敏感人群，第一代表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI）（包括易瑞沙、特羅凱、凱美納）或早或晚仍會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[5,6]，因此，如何克服耐藥提高療效已成為靶向藥治療的重要瓶頸[7,8]。分化抑制因子（differentiation inhibitory factor, ID）是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子[9,10]。近年的研究表明，ID蛋白在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[11]。ID1作為ID蛋白家族成員，在多種腫瘤中呈高表達(dá)，是一種潛在的癌基因[12,13]。有研究[14,15]認(rèn)為ID1與肺癌靶向藥耐藥相關(guān)，但相關(guān)報(bào)道甚少，具體分子機(jī)制未明。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 肺腺癌細(xì)胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R由上海市肺科醫(yī)院中心試驗(yàn)室提供。其中PC-9為EGFR-TKI敏感株，PC-9R為EGFR-TKI獲得性耐藥株，H1975為T(mén)790M突變EGFR-TKI耐藥株，A549、H522為EGFR-TKI原發(fā)耐藥株，獲取我院肺癌手術(shù)患者癌組織及癌旁組織。青霉素、鏈霉素購(gòu)自上海先鋒藥業(yè)公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；RNaseI購(gòu)自Fermentas公司；兔抗人單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；BSA購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；吉非替尼購(gòu)自大連美侖；Realtime檢測(cè)儀購(gòu)自ABI公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Backman Coulter公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R細(xì)胞用10%DMEM含雙抗培養(yǎng)液在細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（溫度為37 ℃且含5%CO2）中培養(yǎng)，次日換液。培養(yǎng)基為90%EMEM，10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有試驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 ID1 siRNA慢病毒載體及ID1過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建ID1 siRNA慢病毒載體構(gòu)建：shRNA序列：5’-CATGAACGGCTGTTACTCA-3’；病毒滴度：8×108U/mL，同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照慢病毒，ID1過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建：ID1基因片段引物：上游5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAAAGTCGCCAGTGGCAG-3’；下游5’-TCCTTGTAGTCCATACCGCGACACAAGATGCGATC-3’。病毒滴度：2×108U/mL，同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照慢病毒。胰酶消化各組肺腺癌細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；顯微鏡下數(shù)出細(xì)胞總數(shù)，熒光顯微鏡觀(guān)察熒光表達(dá)情況。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔懸液約100 μL，以5,000個(gè)/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、CO2培養(yǎng)24 h；棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度吉非替尼（0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h；每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h；吸去上清液，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO），使結(jié)晶物充分溶解；采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的吸光度（A）值，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：［（空白組吸光度平均值-DMSO空白組平均值）-（各組平均值-DMSO空白組平均值）］/（空白組平均值-DMSO空白組平均值） ×100%=抑制率；采用直線(xiàn)回歸方法計(jì)算藥物的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Real-Time PCR檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞ID1 mRNA的表達(dá)情況 去對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的各組肺腺癌細(xì)胞，Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ID1上游引物序列：5’-AAACGTGCTGCTCTACGACA-3’，ID1下游引物序列：5’-GGAACGCATGCCGCCT-3’，GAPDH上游引物序列：5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，GAPDH下游引物序列：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；95 ℃變性10 min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，95 ℃，15 s；60 ℃，45 s；60 ℃延伸1 min。

1.6 免疫組化檢測(cè)ID1蛋白的表達(dá) 選取標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度4 μm。采用免疫組化SP法，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。結(jié)果判斷：所有切片均采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。ID1陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，呈淺黃色、黃色或棕黃色。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野（400倍），每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1,000個(gè)細(xì)胞。最后表達(dá)以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率的得分之和進(jìn)行判斷：無(wú)染色記0分，弱染色記1分，中等染色記2分，強(qiáng)染色記3分；陽(yáng)性細(xì)胞率＜5%記0分，5%-25%記1分，26%-50%記2分，＞50%記3分。上述兩項(xiàng)評(píng)分相加，＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)siRNA慢病毒載體及ID1過(guò)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染的H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解提取蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)以12% SDS-PAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以單克隆抗體4 ℃過(guò)夜孵育以檢測(cè)目標(biāo)蛋白（p-ERK、ERK、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-EGFR、EGFR），GAPDH作為內(nèi)參。洗去一抗，以HRP連接的二抗于室溫孵育2 h，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫印跡條帶。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將肺腺癌細(xì)胞PC-9、PC-9/ID1-OE、PC-9/R、PC-9/R/ID1-KD細(xì)胞接種至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞擴(kuò)增至90%，胰酶消化，接種至BALB/c-nu裸鼠腋下；每只接種1×108個(gè)細(xì)胞。每株肺腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各設(shè)空白對(duì)照和吉非替尼兩組。待腫瘤直徑生長(zhǎng)至3 mm左右時(shí)，空白對(duì)照組使用生理鹽水灌胃治療，吉非替尼組使用吉非替尼灌胃治療（劑量為2 mg/kg/d），每天灌胃一次，持續(xù)4周；4周后，頸椎脫臼法處死，剝離腫瘤組織，測(cè)量腫瘤大小。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以Meab±SD表示，單變量?jī)山M間資料比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ID1在肺癌細(xì)胞株中高表達(dá) 肺癌細(xì)胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R中的ID1 mRNA均有表達(dá)（圖1）。肺癌組織ID1 mRNA的表達(dá)比癌旁組織中高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2A）。肺癌組織ID1蛋白的表達(dá)比癌旁組織中表達(dá)高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2B）。

2.2 ID1與肺癌耐靶向藥的關(guān)系 PC-9R細(xì)胞中ID1 mRNA表達(dá)量高于PC-9細(xì)胞，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1，圖3）。根據(jù)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇PC-9細(xì)胞株感染ID1過(guò)表達(dá)慢病毒載體（ID1-OE），H522、H1975、A549、PC-9R細(xì)胞株感染ID1干擾慢病毒載體。72 h后用熒光顯微鏡觀(guān)察，各組病毒感染率均大于90%，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。MTT法檢測(cè)吉非替尼對(duì)各組細(xì)胞增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PC-9細(xì)胞感染ID1過(guò)表達(dá)慢病毒后，對(duì)吉非替尼的IC50值為0.64 μmol/L，較對(duì)照組（0.05 μmol/L）有一定程度的上升。PC-9R細(xì)胞感染ID1干擾慢病毒后，對(duì)吉非替尼的IC50值為1.14 μmol/L，較對(duì)照組（5.05 μmol/L）有一定程度的下降（表1）。而A549、H522、H1975細(xì)胞在感染ID1干擾慢病毒后，對(duì)吉非替尼的IC50值無(wú)明顯改變。

2.3 各組細(xì)胞株在感染ID1干擾慢病毒后，ID1的表達(dá)情況 慢病毒感染后，H522、H1975、PC-9R、A549細(xì)胞中ID1表達(dá)下降，PC-9細(xì)胞中ID1表達(dá)上升（圖4）。ID1-siRNA慢病毒感染PC-9R后，p-ERK、p-AKT、p-STAT3、p-EGFR有不同程度下降，ERK、AKT、STAT3、EGFR無(wú)明顯改變；吉非替尼處理后，ID1-siRNA組ERK、AKT、EGFR磷酸化程度較對(duì)照組明顯降低。ID1-OE慢病毒感染PC-9后，磷酸及非磷酸ERK、AKT、STAT3、EGFR均無(wú)明顯改變；吉非替尼處理后，PC-9-ID1-OE組AKT、STAT3磷酸化程度較對(duì)照組有一定程度升高（圖5）。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PC-9實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為50.8 mm3，對(duì)照組腫瘤平均體積3,283.6 mm3，腫瘤抑制率為98.5%；PC-9（ID1 OE）實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為465.5 mm3，對(duì)照組腫瘤平均體積為1,084.7 mm3，腫瘤抑制率為57.1%，組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。PC-9/R實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為81.2 mm3，PC-9/R對(duì)照組腫瘤平均體積為371.8 mm3（圖5A），腫瘤抑制率為78.2%；PC-9/R（ID1 siRNA）實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均體積為0，對(duì)照組腫瘤平均體積為85.3 mm3（圖5B），腫瘤抑制率為100%，組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2），值得注意的是，ID1基因沉默后，PC-9/R腫瘤生長(zhǎng)極為緩慢，28 d僅增長(zhǎng)0.9倍。

3 討論

本研究證實(shí)了ID1參與非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI耐藥，且與手術(shù)患者預(yù)后相關(guān)。在探討ID1是否參與肺癌靶向藥耐藥的相關(guān)研究中，我們檢測(cè)了PC9及PC-9/R、H1975、A549、H522多組肺癌細(xì)胞株中ID1 mRNA。發(fā)現(xiàn)PC-9細(xì)胞中ID1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較低，而PC-9/R細(xì)胞則明顯升高，說(shuō)明ID1與肺癌EGFR-TKI耐藥相關(guān)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)H1975、A549、H522多組肺癌細(xì)胞株中ID1高表達(dá)，故對(duì)非小細(xì)胞肺癌手術(shù)標(biāo)本免疫組化及RT-PCR檢測(cè)，提示ID1在肺癌組織中較正常組織明顯升高（P＜0.05）；分層分析顯示，病理類(lèi)型對(duì)ID1表達(dá)有意義，在鱗癌患者中呈高表達(dá)；分期及性別與ID1表達(dá)無(wú)相關(guān)性；1年OS與ID1表達(dá)分析提示，ID1與肺癌預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步探討ID1與非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI耐藥的相關(guān)性：使用慢病毒干擾技術(shù)，過(guò)表達(dá)及沉默肺癌細(xì)胞株ID基因的表達(dá)，再檢測(cè)ID1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：PC-9細(xì)胞感染ID1過(guò)表達(dá)慢病毒后，對(duì)吉非替尼的IC50值為0.64 μmol/L，較對(duì)照組（0.05 μmol/L）有一定程度的上升，說(shuō)明PC-9敏感性降低；PC-9/R細(xì)胞感染ID1干擾慢病毒后，對(duì)吉非替尼的IC50值為1.14 μmol/L，較對(duì)照組（5.05 μmol/L）有一定程度的下降，說(shuō)明PC-9/R耐藥性降低（表1）。荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果：PC-9 ID1-OE吉非替尼用藥組腫瘤體積大于PC-9吉非替尼用藥組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，吉非替尼處理后，ID1-siRNA組ERK、AKT、EGFR磷酸化程度較對(duì)照組明顯降低，ID1-OE組AKT、STAT3磷酸化程度較對(duì)照組有一定程度升高。這說(shuō)明：ID1表達(dá)量與肺癌EGFR-TKI耐藥性呈正相關(guān)；STAT3可能通過(guò)磷酸化機(jī)制參與EGFR-TKI耐藥。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，STAT3的siRNA或抑制劑通過(guò)抑制STAT3激活，增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。但目前STAT3介導(dǎo)吉非替尼耐藥的機(jī)制還不是很明確，需要進(jìn)一步研究。

圖1 肺癌細(xì)胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R中的ID1 mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）Fig 1 Relative expression of ID1 mRNA in H522, H1975, A549, PC-9 and PC-9R lung cancer cell lines (P＜0.05)

圖2 ID1在肺癌組織與癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。A：肺癌組織ID1 mRNA的表達(dá)量比癌旁組織中ID1 mRNA的表達(dá)量高（P＜0.05）；B：肺癌組織ID1蛋白的表達(dá)比癌旁組織中ID1蛋白的表達(dá)高（P＜0.05）。Fig 2 Relative expression of ID1 in lung cancer tissues and adjacent tissues.A: The expression of ID1 mRNA in lung cancer tissues is relatively higher than that in adjacent tissues (P＜0.05); B, C: The expression of ID1 protein in lung cancer tissues is higher than that in adjacent tissues(P＜0.05).iOD: integral optical density.

圖3 PC-9R細(xì)胞中ID1 mRNA表達(dá)量高于PC-9細(xì)胞（P＜0.05）。Fig 3 The expression of ID1 mRNA in PC-9/R cell lines is higher than that in PC-9 cell lines (P＜0.05).

本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞、動(dòng)物到臨床標(biāo)本深入探討了ID1與肺癌之間的關(guān)系，證實(shí)ID1在肺癌組織中高表達(dá)，其中以腺癌尤為明顯，且ID1參與非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的獲得性耐藥。ID1或可成為非小細(xì)胞肺癌有價(jià)值的檢測(cè)項(xiàng)目[17]；ID1參與肺癌對(duì)EGFR-TKI的耐藥，可能與STAT3的磷酸化有關(guān)，具體機(jī)制還有待我們接下來(lái)更深入地研究[17]。

圖4 慢病毒感染后，各組細(xì)胞ID1的表達(dá)情況以及PC-9R中不同信號(hào)通路的酶表達(dá)情況。A：慢病毒感染后，H522、H1975、PC-9R、A549細(xì)胞中ID1表達(dá)下降，PC-9細(xì)胞中ID1表達(dá)上升；B：ID1-siRNA慢病毒感染PC-9R后，p-ERK、p-AKT、p-STAT3、p-EGFR有不同程度下降，ERK、AKT、STAT3、EGFR無(wú)明顯改變；吉非替尼處理后，ID1-siRNA組ERK、AKT、EGFR磷酸化程度較對(duì)照組明顯降低。ID1-OE慢病毒感染PC-9后，磷酸及非磷酸ERK、AKT、STAT3、EGFR均無(wú)明顯改變；吉非替尼處理后，PC-9-ID1-OE組AKT、STAT3磷酸化程度較對(duì)照組有一定程度升高。Fig 4 After slow viral infection, groups of cells expressed the ID1 enzyme in different signaling pathways of PC-9R.A: After infection of ID1-siRNA; ID1 expression decreases in H522, H1975, PC-9R, and A549 while increasing in PC-9;B: After infection of ID1-siRNA in PC-9R, p-ERK, p-AKT, p-STAT3 and p-EGFR decreased, whereas ERK, AKT, STAT3 and EGFR showed no change.Following gefitinib treatment, the extent of phosphorylation of ERK, AKT and EGFR in ID1-siRNA is lower than that in the control group.After infection of ID1-OE in PC-9, the extent of phosphorylation or non-phosphorylation of ERK, AKT and EGFR showed no change.After gefitinib treatment, the extent of phosphorylation of AKT and STAT3 in PC-9-ID1-OE is higher than that in the control group.

圖5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A：PC-9/R（ID1-OE）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（標(biāo)尺上方，第一行：對(duì)照組剝離腫瘤；第二行：灌胃組剝離腫瘤）；B：PC-9R（ID1-siRNA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（標(biāo)尺上方，第一行：對(duì)照組剝離腫瘤，第二行：灌胃組因腫瘤消失，故空行），值得注意的是，ID1基因沉默后，PC-9R（ID1 siRNA）腫瘤生長(zhǎng)極為緩慢，28天僅增長(zhǎng)0.9倍。Fig 5 Animal experiment.A: Experimental result of PC-9/R (ID1-OE)(Above scale, first line: control group stripping tumor, second line:lavage group stripping tumor); B: Experimental result of PC-9/R(ID1-siRNA) (Above scale, first line: control group stripping tumor,second line: when the tumor disappears, the lavage group is zero).Notably, with silence of the ID1 gene, tumor growth is very slow in PC-9R (ID1 siRNA), which grew only 0.9 times after 28 days.

表1 各組腫瘤細(xì)胞IC50值和吉非替尼處理后凋亡率Tab 1 IC50 value in groups of tumor cells and apoptosis rate after treatment with gefitinib

表2 吉非替尼治療組與對(duì)照組的瘤體體積與抑瘤率Tab 2 Gefitinib treatment group and control group in the volume of tumors and inhibitory rate