李明彪 徐嵩 范海洋 張宏毅 李穎 李永文 劉明輝 劉紅雨 陳軍

肺類癌（pulmonary carcinoid, PC）起源于支氣管肺黏膜的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（Kitchitsky細(xì)胞），屬于肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。其病理類型分為典型類癌（typical carcinoid,TC）和非典型類癌（atypical carcinoid, AC），其判斷標(biāo)準(zhǔn)為：TC＜2個(gè)有絲分裂/高倍視野，AC為2個(gè)-10個(gè)有絲分裂/高倍視野，且可伴有組織壞死和結(jié)構(gòu)破壞。根據(jù)國際診斷的標(biāo)準(zhǔn)，PC的生物學(xué)特性雖不活躍，但仍具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力，常見胸外轉(zhuǎn)移部位為肝、骨、腦和腎上腺[1-4]。根據(jù)2015版世界衛(wèi)生組織肺腫瘤分類，將TC、AC與小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）、大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌因?yàn)榫哂猩窠?jīng)內(nèi)分泌功能而歸屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine tumor, NET）[5]。在發(fā)病率方面，PC是極少見的惡性腫瘤[3]，在美國一項(xiàng)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查[6]顯示其年發(fā)病率約僅為十萬分之0.3-1.35，而我國尚無明確發(fā)病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。支氣管PC患者年齡分布較廣（4歲-86歲），TC與AC中位發(fā)病年齡在50歲左右，男女無差異；但在＜30歲的患者中，AC不足10%[7]。肺部的NET無特異性的臨床癥狀，甚至大多數(shù)患者不會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀。部分患者可表現(xiàn)為神經(jīng)內(nèi)分泌癥狀，臨床多特征性表現(xiàn)為急性腹瀉、膚色潮紅、心悸、哮喘樣癥狀和頭痛[1,8]。PC的診斷主要依據(jù)組織病理，治療首選外科手術(shù)切除，一般早期患者術(shù)后預(yù)后較好，5年生存率可達(dá)90%，然而仍有部分患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥[3,9]。

腫瘤的免疫治療是目前研究的主要熱點(diǎn)之一。免疫檢查位點(diǎn)PD-1與其配體PD-L1可以負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷反應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，避免免疫細(xì)胞的殺傷，因此PD-1與PD-L1的靶點(diǎn)抑制劑可以克服抗腫瘤細(xì)胞的免疫逃離，從而達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞的作用[10]?，F(xiàn)有的研究表明，PD-1與PD-L1在一些惡性腫瘤如黑色素瘤、腎癌以及肺癌中存在異常的表達(dá)[11,12]，且PD-1與PD-L1的表達(dá)可能與此類惡性腫瘤的臨床病理特征和不良預(yù)后相關(guān)[13]。目前，針對(duì)PD-1與PD-L1的靶點(diǎn)抑制劑，如Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Durvalumab等，已在黑色素瘤、腎癌、肺癌等惡性腫瘤的免疫治療中取得了良好的效果[14-17]。本研究旨在探討PC組織中PD-1與PD-L1的表達(dá)情況和與患者的臨床病理生理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步應(yīng)用針對(duì)PD-1和PD-L1的PC免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患者基本臨床資料與標(biāo)本采集 20例病理明確的PC患者的組織標(biāo)本均來自于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科2008年1月-2015年12月的手術(shù)病例，組織標(biāo)本的應(yīng)用均通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和患者的同意。其中，14例患者行肺葉切除術(shù)，6例患者行亞肺葉切除術(shù)；17例患者行了系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)，3例患者因腫瘤最大直徑＜1 cm，且為周圍型而未行淋巴結(jié)采樣?；颊叩呐R床資料和特征見表1，每例患者的病理檢測(cè)均經(jīng)我院兩位病理科醫(yī)師會(huì)診確診。

1.2 免疫組化 組織標(biāo)本的固定及包埋等處理過程按我院病理科常規(guī)，腫瘤組織標(biāo)本應(yīng)用4 μm的石蠟切片。首先應(yīng)用原裝脫蠟液中經(jīng)過40 min脫洗進(jìn)行脫蠟處理，再分別經(jīng)無水酒精、95%酒精、85%酒精及70%酒精各10 min進(jìn)行水化，在微波爐中使用相應(yīng)的抗原修復(fù)液進(jìn)行腫瘤組織的抗原修復(fù)30 min。

PD-1與CD8行雙染法染色：CD8抗體來自基因科技（上海）公司C8/114B，T細(xì)胞鼠抗人單克隆抗體，經(jīng)過1:25稀釋后使用；PD-1抗體是來自SIGMA公司的兔抗人單克隆抗體，經(jīng)1:50稀釋后使用。PD-1附著后4 ℃下過夜，CD8使用邁新試劑的免疫組化雙染試劑盒染色。PD-L1抗體是來自Cell Signaling Technology，（E1L3N）XP兔抗人單克隆抗體，經(jīng)稀釋液1:100稀釋后使用，在4 ℃下過夜，使用中杉金橋BAD顯色劑，三步顯色。

PD-1是表達(dá)于CD8陽性T細(xì)胞的細(xì)胞膜，使用PD-1與CD8雙染色，避免其他非CD8陽性T細(xì)胞的干擾。PD-1的染色強(qiáng)度與PD-L1相同，然而由于T細(xì)胞數(shù)目有限，按照慣例，使用PD-1陽性的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行評(píng)分。

PD-L1是表達(dá)于腫瘤細(xì)胞及周圍炎性細(xì)胞的胞膜，根據(jù)其染色強(qiáng)度和染色比例進(jìn)行半定量數(shù)據(jù)分析。按染色強(qiáng)度分0、1+、2+和3+。0：在背景下沒有細(xì)胞膜任何著色，記為陰性；1+：在細(xì)胞膜上輕度的染色，較2+、3+弱；2+：在細(xì)胞膜可見中等強(qiáng)度的染色；3+：在細(xì)胞膜可見強(qiáng)陽性，甚至胞膜周圍出現(xiàn)深然顆粒。H-scores（HS）評(píng)分系統(tǒng)[18]：在400×的高倍鏡視野下HS=陽性細(xì)胞比例×染色強(qiáng)度，分別隨機(jī)取5個(gè)-8個(gè)視野并計(jì)算HS平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 此次研究的主要目的是探索在PC中PD-1/PD-L1的表達(dá)情況和其與肺癌患者的不同病理分類、病理分期及臨床特征的關(guān)系。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用IBM公司的SPSS軟件（版本21），采用卡方檢驗(yàn)或Fish精確檢驗(yàn)法，分別計(jì)算PD-1和PD-L1陽性患者的臨床特征及病理類型的關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者資料與臨床特征 患者的臨床特征如表1所示：在20例PC患者中，男性15例，女性5例；年齡范圍是14歲-71歲，中位年齡為48.5歲；11例有吸煙史，9例無吸煙史；20例患者均接受了手術(shù)治療，具有明確的病理診斷，其中，TC 8例，AC 12例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5例（均為AC），侵及上腔靜脈大血管者3例；臨床病理分期，I期-II期12例，III期8例。

2.2 PD-1在PC組織中CD8+淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況 PD-1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞周圍浸潤(rùn)的CD8（+）的T淋巴細(xì)胞的胞膜。如圖1A-圖1D所示，應(yīng)用PD-1/CD8雙染的方法來確定PD-1的陽性表達(dá)情況，在顯微鏡下，PD-1為深藍(lán)色，CD8為淺紅色，二者均表達(dá)在淋巴細(xì)胞的胞膜上，部分抗體可呈現(xiàn)顆粒狀聚集，二者疊加在鏡下顯示為藍(lán)黑色。在所有類癌患者的腫瘤組織中，PD-1（+）和CD8（+）雙陽性的T淋巴細(xì)胞數(shù)均大于50，其中部分PC組織中可見只表達(dá)CD8（+）PD-1（-）的T淋巴細(xì)胞，但未見PD-1（+）CD8（-）的淋巴細(xì)胞。如表1所示，20例類癌患者中PD-1表達(dá)陽性者8例，陽性表達(dá)率為40%（8/20）。在吸煙患者中PD-1的陽性表達(dá)率為63.64%（7/11），明顯高于不吸煙患者（11.11%,1/9）（P=0.028）；PD-1的陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型、病理分期和有無轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

2.3 PD-L1在PC細(xì)胞中的表達(dá)情況 如圖1E-圖1H所示，PD-L1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜上，DAB顯色后鏡下為棕色。當(dāng)HS＞0時(shí)，認(rèn)為PD-L1有表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判，20例類癌中有9例患者PD-L1表達(dá)為陽性，其陽性表達(dá)率為45%（9/20）。與PD-1的表達(dá)不同的是，在吸煙的患者中PD-L1的陽性表達(dá)率為45.45%（5/11），與不吸煙的患者基本相似（44.44%, 4/9），組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；此外，PD-L1的陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型、病理分期和有無轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表1）。

表2所示為PD-1/PD-L1表達(dá)陽性的PC患者的臨床具體特征，其中在PD-1或/和PD-L1表達(dá)陽性的患者中，5例患者同時(shí)存在PD-1和PD-L1的表達(dá)陽性，共同陽性率為25%（5/20）。這5例患者的臨床特征如下：有吸煙史、男性4例，無吸煙史、女性1例；患者年齡在25歲-70歲之間，中位年齡48歲；TC 1例，AC 4例。由于臨床病例數(shù)的不足，不能分析出此類患者的PD-1和PD-L1的兩者陽性表達(dá)是否存在相關(guān)性。

2.4 PD-1與PD-L1陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 20例PC患者術(shù)后隨訪時(shí)間為15個(gè)月-96個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為48個(gè)月，其中1例晚期AC患者因術(shù)后7個(gè)月出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移而死亡，其余19例患者現(xiàn)均生存，故目前尚不能分析PD-1/PD-L1的陽性表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)性。如圖2A-圖2D所示，死亡患者為男性，49歲，胸部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描顯示右肺上葉腫物伴右肺中葉轉(zhuǎn)移和縱隔淋巴結(jié)腫大，行右肺中上葉切除，系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后病理診斷為右上肺AC伴右肺中葉肺內(nèi)轉(zhuǎn)移和縱隔淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（T4N2M0, IIIb），患者術(shù)后接受標(biāo)準(zhǔn)的TP方案（多西他賽130 mg+奧沙利鉑220 mg）化療4次，7個(gè)月后因腦轉(zhuǎn)移死亡。PD-1/PD-L1的免疫組化結(jié)果如圖2E-圖2H所示，在400倍鏡下，PD-1陽性細(xì)胞數(shù)大于100（圖2E-圖2F），PD-L1的HS大于120（圖2G-圖2H），為PD-1和PD-L1雙陽性的患者。

3 討論

PC在肺癌中發(fā)病率極低，確診以病理診斷為主。其特異性免疫組化標(biāo)記物主要有chromogranin A （CgA）、CD56、synaptophysin、neuron-specific enolase （NSE），然而這些標(biāo)記物與PC的臨床特征及預(yù)后無明確相關(guān)性。PC患者術(shù)后預(yù)后一般較好，然而部分PC亦有高的侵襲性，易導(dǎo)致患者死亡[9]。目前，腫瘤的免疫治療是研究的主要熱點(diǎn)，其中PD-1或PD-L1的阻斷劑在包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的初步臨床研究中取得可靠的治療效果[10]。雖然，PD-1或/和PD-L1的表達(dá)尚不能完全確定為PD-1或PD-L1的阻斷劑治療有效與否的主要標(biāo)記物，但在許多的研究[19]中PD-L1的表達(dá)仍被建議作為一個(gè)使用抗PD-1/PD-L1療法的標(biāo)記。目前，PC組織中的PD-1/PD-L1表達(dá)及抗PD-1/PD-L1治療的研究報(bào)道甚少。

表1 20例肺類癌患者的臨床特征和PD-1/PDL1的表達(dá)情況Tab 1 The clinical characteristics of 20 patients with PC and their expressions of PD-1/PD-L1

表2 肺類癌PD-1/PD-L1陽性患者的臨床特征Tab 2 Clinical features of PC patients with the positive expressions of PD-1/PD-L1

圖1 PD-1和PD-L1在肺類癌組織中的表達(dá) (×400)。A-D：PD-1和CD8雙染色。A：PD-1染色陰性，單純CD8染色，呈現(xiàn)淡紅的；B：PD-1染色1+，在細(xì)胞膜上輕度的藍(lán)染色；C：PD-1染色2+，在細(xì)胞膜可見中等強(qiáng)度的深藍(lán)染色；D：PD-1染色3+, 在細(xì)胞膜可見藍(lán)黑染色強(qiáng)陽性，甚至胞膜周圍出現(xiàn)深然藍(lán)黑顆粒。E-H：PD-L1染色。E：PD-L1染色0，在背景下沒有細(xì)胞膜任何著色，即表達(dá)陰性；F：PD-L1染色1+，在細(xì)胞膜上輕度棕紅色的染色，較2+、3+弱；G：PD-L1染色2+，在細(xì)胞膜可見中等強(qiáng)度棕色的染色；H：PD-L1染色3+，在細(xì)胞膜可見深棕色強(qiáng)陽性，甚至胞膜周圍出現(xiàn)深然顆粒。染色強(qiáng)度分0、1+、2+和3+。Fig 1 The expression of PD-1 and PD-L1 in pulmonary carcinoid tissues by Immunohistochemistry detection (Original Magnification,×400).A-D: The staining for PD-1 and CD8.A: PD-1 staining was negative, pure CD8 staining, showing pink; B: PD-1 stained 1+，mild blue staining on the cell membrane; C: PD-1 staining 2+, PD-1 visible blue staining in the cell membrane of moderate intensity,pure CD8 staining, showing light red; D: PD-1 staining 3+, PD-1 Black and blue visible in the cell membrane staining strongly positive,then even the membrane around the deep blue-black particles.E-H: The staining for PD-L1.E: PD-L1 staining 0, in the context of the membrane without any coloring, i.e. negative expression; F: PD-L1 staining 1+, slightly brown-red in the cell membrane staining,representing 2+, 3+ weak: G: PD-L1 staining 2+ in the cell membrane visible moderate brown staining; H: PD-L1 staining 3+, visible in dark brown membrane strongly positive, even around the deep natural membrane particles.Staining intensity points: 0, 1+, 2+, and 3+.

2014年底美國食品和藥物管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，肺癌組織中PD-L1的表達(dá)被建議作為一個(gè)使用抗PD-1/PD-L1療法標(biāo)記。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PC中PD-1/PD-L1表達(dá)率分別為40%和45%，完全符合NSCLC的表達(dá)率，文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道PD-1/PD-L1陽性率一般分別為40%-60%與35%-95%，特別是在吸煙史的類癌患者中，PD-1的陽性表達(dá)率為63.64%，明顯高于不吸煙的患者。因此對(duì)于晚期肺類癌，使用抗PD-1/PD-L1的療法提供了一種新的治療可能。已經(jīng)有研究[23]表明PD-1抗體的效果與腫瘤細(xì)胞的突變程度有關(guān)系，突變?cè)蕉嘈Ч赡芫驮胶?。如惡性黑色素瘤的突變頻率很高，所以這種腫瘤對(duì)PD-1抗體治療很敏感[24]。研究報(bào)道在458例有明確吸煙史的患者中，使用Opdivo（PD-1抑制劑）的效果明顯優(yōu)于無吸煙史患者（HR=0.7）；而對(duì)于從來不抽煙的118例患者，從HR值來看，Opdivo效果和多西他賽無明顯差異。研究[15]認(rèn)為抽煙會(huì)讓腫瘤細(xì)胞有更多的突變。已經(jīng)有研究表明PD-1抗體的效果跟腫瘤細(xì)胞的突變程度有關(guān)系，突變?cè)蕉嘈Ч赡芫驮胶?。惡性黑色素瘤的突變頻率很高，所以這種腫瘤對(duì)PD-1抗體治療很敏感[24]。在20例患者隨訪過程中，目前只有1例患者死于腫瘤的轉(zhuǎn)移，該患者的PD-1/PD-L1的表達(dá)率均為強(qiáng)陽性。文獻(xiàn)[9]報(bào)道PC的死亡率極低，與本組患者的目前隨訪結(jié)果相符。然而在一些惡性腫瘤如黑色素瘤和腎癌的研究中，亦有文獻(xiàn)[11,25]報(bào)道PD-1/PD-L1高表達(dá)的患者提示預(yù)后不良。由于本組患者總體例數(shù)和死亡患者的比例均較低的原因，在該研究中不能證實(shí)這一點(diǎn)。

圖2 肺類癌患者的胸部CT和其肺癌組織中PD-1/PD-L1表達(dá)情況。A-B：右肺上葉見一大小為4 cm×5 cm腫物，侵及上腔靜脈；C-D：右肺中葉亦見一大小為2 cm×2 cm腫物；E-F：PD-1表達(dá)呈強(qiáng)陽性（200×/400×）；G-H：PD-L1表達(dá)呈強(qiáng)陽性（200×/400×）。Fig 2 The chest CT scan and the expression of PD-L1 and PD-1 for the patient who died due to pulmonary carcinoid.A-B: There was a tumor size of 4 cm×5 cm mass in the right upper lobe, which invaded the superior vena cava; C-D: There was also a tumor size of 2 cm×2 cm lesion in the right middle lobe; E-F: the strongly positive expression of PD-1 (3+; 200×/400×); G-H: the strongly positive expression of PD-L1 (3+; 200×/400×).

目前，由于不同生產(chǎn)廠家的PD-1/PD-L1抗體的效價(jià)不同，免疫組化染色的半定量統(tǒng)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一和PD-1/PD-L1陽性臨界值公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的缺乏，使得不同文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌患者中PD-1/PD-L1的陽性率差別很大。在本組實(shí)驗(yàn)中，我們參用了大多文獻(xiàn)常用的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)即PD-1/CD8雙陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)大于零為陽性，PD-L1的表達(dá)以HS＞0為陽性的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了判斷。從而在本組類癌患者中，PD-1和PD-L1的陽性表達(dá)率均大于40%，但這些患者能否在針對(duì)PD-1和PD-L1抗體的治療中獲益目前仍缺乏必要的臨床研究。大宗此類病例的進(jìn)一步研究必將為PD-1/PD-L抗體在臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，此次研究中，PC組織中的 PD-1與PD-L1的表達(dá)率明顯高于遠(yuǎn)癌肺組織，應(yīng)用PD-1/PD-L抗體的免疫治療也許可以在PC患者的治療中獲益。