皮志媛，何曉杰，葉爾保勒，阿斯喀，王振寶*

(1．伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2．伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆伊寧 835000)

?

牛肉中金黃色葡萄球菌的復(fù)核鑒定研究

皮志媛1，何曉杰1，葉爾保勒2，阿斯喀2，王振寶2*

(1．伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2．伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆伊寧 835000)

[目的]采用2種方法復(fù)核檢出牛肉中金黃色葡萄球菌陽性結(jié)果，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。[方法]按照GB 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》方法前增菌、選擇性分離培養(yǎng)、革蘭氏染色和血漿凝固酶試驗鑒定金黃色葡萄球菌，應(yīng)用SN/T 1870—2007《食品中致病菌檢測方法 實時PCR法》對疑似陽性結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗證和復(fù)核。[結(jié)果]經(jīng)過2種方法驗證可疑菌落，該批牛肉中檢出金黃色葡萄球菌。[結(jié)論]分離并鑒定牛肉中金黃色葡萄球菌可疑樣品時，可采用不同方法進(jìn)行驗證和復(fù)核，該方法可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，可用于畜禽肉中致病菌的檢測。

金黃色葡萄球菌；復(fù)核鑒定；牛肉

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，是人和動物的常見病原菌，隸屬葡萄球菌屬(Staphylococcus)，革蘭氏陽性菌，可引起多種嚴(yán)重感染，有“嗜肉菌”的別稱，其所導(dǎo)致的食物中毒主要是由腸毒素引起的。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，在空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到[1-2]。由金黃色葡萄球菌引起食物中毒的食品主要有肉、蛋、乳及其制品等[3-4]。我國生鮮肉流通和運輸環(huán)節(jié)包裝簡單或不包裝，增加了其在運輸、儲存和消費過程中受到二次污染的機(jī)率，金黃色葡萄球菌成為我國肉品檢測過程中重要的檢測項目之一[5]。目前，對肉中金黃色葡萄球菌的檢驗大多采用GB 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》方法，按照前增菌、選擇性分離培養(yǎng)、革蘭氏染色和血漿凝固酶試驗等流程鑒定金黃色葡萄球菌[6]，該方法由于受檢測人員的專業(yè)水平和經(jīng)驗等多種因素的限制，容易出現(xiàn)誤判[7]，且血漿凝固酶試驗易受到金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)時間、反應(yīng)時間和體積等因素的影響，從而經(jīng)常出現(xiàn)延遲凝固的現(xiàn)象，易造成漏檢[8]。針對上述問題，為了提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者對國標(biāo)方法檢出的牛肉中金黃色葡萄球菌可疑樣品應(yīng)用SN/T 1870—2007《食品中致病菌檢測方法 實時PCR法》[9]進(jìn)行了進(jìn)一步驗證和復(fù)核，以期為畜禽肉中致病菌的檢測提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品選取送檢的鮮牛肉樣品進(jìn)行試驗。

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株與試劑金黃色葡萄球菌陽性菌株，由伊犁出入境檢驗檢疫局實驗室保存。7.5%氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、腦心浸出液肉湯(BHI)、兔血漿、革蘭氏染色液，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；金黃色葡萄球菌鑒定引物和探針、chelex 100粉末、PCR試劑等，均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3儀器恒溫培養(yǎng)箱(賓得400型)、實時熒光定量PCR儀(ABI 7500型)、天平(梅特勒MS1602S型)、均質(zhì)器(AES EasyMix型)、離心機(jī)(貝克曼Allegra X-22R型)。

1.4樣品的處理無菌操作取樣，制成勻質(zhì)檢樣，稱取25 g勻質(zhì)檢樣至盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液，用于金黃色葡萄球菌的檢測。

1.5增菌將上述樣品勻液于(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h。

1.6分離培養(yǎng)將上述培養(yǎng)物分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h，Baird-Parker平板(36±1)℃下培養(yǎng)45～48 h，培養(yǎng)結(jié)束后觀察菌落生長特征。

挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個及以上，接種到5 mL BHI，(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h。同時，進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.7血漿凝固酶試驗取新鮮配制兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2～0.3 mL，振蕩搖勻，置于(36±1)℃溫箱內(nèi)，每30 min觀察1次，觀察6 h。同時，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株肉湯、陰性葡萄球菌菌株的肉湯和BHI肉湯空白培養(yǎng)基為對照。

1.8實時熒光定量PCR檢測

1.8.1模板DNA的制備。

1.8.1.1增菌液模板DNA的制備。分別取“1.5”和“1.6”中培養(yǎng)的7.5%氯化鈉肉湯增菌液和BHI培養(yǎng)物各1 mL，分別加入1.5 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清；每管加入50 μL DNA提取液(使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸取)，混勻后沸水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清保存于-20 ℃下備用。

1.8.1.2可疑菌落模板DNA的制備。挑取“1.6”中Baird-Parker平板和血平板上的可疑菌落，分別加入50 μL DNA提取液，混勻后沸水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清保存于-20 ℃，備用。

1.9實時熒光定量PCR檢測

1.9.1實時熒光定量PCR反應(yīng)體系。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×PCR緩沖液2.5 μL、引物對(10 μmol/L)各1 μL、探針(10 μmol/L)1 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、水16 μL、模板DNA 2 μL。

1.9.2實時熒光定量PCR反應(yīng)條件。37 ℃ 5 min，95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸40 s，同時收集FAM熒光，進(jìn)行40個循環(huán)；4 ℃下保存。

1.9.3檢測質(zhì)控。檢測過程中分別設(shè)置陽性對照(陽性菌株DNA)和空白對照(無菌水)。

2　結(jié)果與分析

2.17.5%氯化鈉肉湯增菌樣品勻液在7.5%氯化鈉肉湯中于36.5 ℃條件下培養(yǎng)24 h，呈現(xiàn)混濁生長。

2.2分離菌在Baird-Parker和血平板上的培養(yǎng)特性在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰色至黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有1個透明圈。用接種針接觸菌落時，有似奶油至樹膠樣的硬度。在血平板上，菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、白色，菌落周圍可見完全透明溶血圈。

2.3分離菌的革蘭氏染色特征革蘭氏陽性球菌，呈紫色，圓形，呈單個短鏈和葡萄串狀排列，無芽孢、無莢膜，直徑約為0.5～1.0 μm。

2.4血漿凝固酶試驗標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和待檢分離菌均使血漿凝固，將試管傾斜或倒置時呈現(xiàn)凝塊，而陰性對照菌株和BHI肉湯空白培養(yǎng)基均無凝固現(xiàn)象，因此判定分離菌株的血漿凝固酶試驗為陽性。

2.5實時熒光定量PCR檢測分別對分離培養(yǎng)檢樣的7.5%氯化鈉肉湯增菌液、BHI肉湯培養(yǎng)物、Baird-Parker平板和血平板上的可疑菌落進(jìn)行了實時熒光定量PCR檢測，陰性和陽性對照成立，樣品Ct值≤35.0，判定樣品檢測結(jié)果均為陽性(圖1)。

注：1．陽性對照；2．Baird-Parker平板上菌落；3．血平板上菌落；4．BHI肉湯培養(yǎng)物；5．7.5%氯化鈉肉湯增菌液；6．空白對照(無菌水)。Note: 1. Positive control; 2．Colony on Baird-Parker agar plate; 3. Colony on blood plate; 4. Brain heart infusion (BHI) broth culture; 5. 7.5% sodium chloride broth culture; 6. Blank control (ddH2O).圖1　實時熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig.1　The result of real-time fluorescent quantitative PCR

3　結(jié)論與討論

筆者采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法中選擇性培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)和分離、顯微鏡下形態(tài)學(xué)鑒定、溶血現(xiàn)象、血漿凝固酶試驗等開展牛肉中金黃色葡萄球菌的檢測，分離鑒定出牛肉中金黃色葡萄球菌可疑菌落，并運用實時熒光定量PCR方法進(jìn)行了結(jié)果復(fù)核，檢測結(jié)果相一致，確保了檢測的準(zhǔn)確性。陳麗麗等[10]建立了金黃色葡萄球菌分離鑒定的質(zhì)量控制方法，采用血漿凝固酶試驗、生化鑒定、實時熒光定量PCR等方法進(jìn)行質(zhì)控確證，驗證了3種試驗方法檢測結(jié)果的相關(guān)性，試驗表明菌株鑒定時可采取多種檢測方法，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實際檢測工作中分離并鑒定金黃色葡萄球菌可疑樣品時，可采用不同的試驗方法進(jìn)行驗證和復(fù)核，該研究結(jié)果對畜禽肉中致病菌的準(zhǔn)確檢測具有參考價值和指導(dǎo)意義。

[1] 孫燕萍．對畜禽生肉及養(yǎng)殖環(huán)境表面分離的金黃色葡萄球菌的藥敏分析[J]．中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2015(3)：178-179．

[2] 鄭向梅，呂均，李玉芳，等．規(guī)?；B(yǎng)豬場金黃色葡萄球菌污染狀況調(diào)查分析[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(12)：2986-2987．

[3] 李嬌，董慶利，陸柏益，等．國內(nèi)外原料乳中金黃色葡萄球菌風(fēng)險評估研究綜述[J]．乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2015，38(1)：26-31．

[4] 周少君，梁輝，朱海明，等．廣東省熟肉制品中金黃色葡萄球菌的污染調(diào)查及初步風(fēng)險評價[J]．中國食品衛(wèi)生雜志，2014，26(5)：496-500．

[5] 李苗云，惠利娜，趙改名，等．熒光定量PCR檢測生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌的應(yīng)用研究[J]．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，48(4)：475-480．

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2010[S]．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[7] 姜侃，呂沁風(fēng)，汪新，等．三重LAMP法檢測食品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌[J]．食品科學(xué)，2013，34(24)：182-187．

[8] 劉真真，林濤，李光偉，等．金黃色葡萄球菌不同培養(yǎng)與反應(yīng)條件對其血漿凝固酶的影響[J]．檢驗檢疫科學(xué)，2005(5)：34-35．

[9] 國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會.食品中致病菌檢測方法 實時PCR法：SN/T 1870—2007[S]．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[10] 陳麗麗，劉麗萍，徐嵐．鎮(zhèn)江市食源性金黃色葡萄球菌檢測質(zhì)量控制研究[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015，25(5)：655-657．

Study on Identification ofStaphylococcusaureusfrom Beef

PI Zhi-yuan1, HE Xiao-jie1, YE’ER Bao-le2, WANG Zhen-bao2*et al

(1. Yili Vocational and Technical College, Yining, Xinjiang 835000; 2. Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yining, Xinjiang 835000)

[Objective] Two methods were used to review positive results ofStaphylococcusaureusfrom beef to ensure the accuracy of test results. [Method] According to theFoodMicrobiologicalExamination:StaphylococcusaureusTest(GB 4789.10—2010),S.aureusfrom beef was identified through propagation of bacteria, selective separation culture, Gram staining, and plasma coagulase test, and the suspected positive results ofStaphylococcusaureusfrom beef were verified and reviewed according to theDetectionofPathogensinFood—Real-timePCRMethod(SN/T 1870—2007). [Result] The identification of questionable colony by the two methods indicated that there wasS.aureusin beef. [Conclusion] The two methods can be used to verify and review the identification results of suspected samples ofS.aureusfrom beef, and they are more accurate and can be used to detect pathogens in livestock and poultry meat.

Staphylococcusaureus; Identification; Beef

伊犁州直科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(YZ201302017)。

皮志媛(1987- )，女，天津人，助教，碩士，從事動物檢驗檢疫工作。*通訊作者，獸醫(yī)師，碩士，從事動物檢驗檢疫工作。

2016-05-16

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)19-176-02