溫梓辰，榮 雪，郭乃菲，陳點(diǎn)點(diǎn)，王慧妍，胡 丹，劉廣斌

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

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反復(fù)凍融法對(duì)枸杞多糖溶出率的研究

溫梓辰，榮 雪，郭乃菲*，陳點(diǎn)點(diǎn)，王慧妍，胡 丹，劉廣斌

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

[目的] 探究反復(fù)凍融法對(duì)枸杞多糖溶出率的影響。[方法]通過對(duì)解凍溫度、凍結(jié)時(shí)間、凍融次數(shù)、凍結(jié)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，驗(yàn)證反復(fù)凍融法對(duì)枸杞多糖的提取效果影響。[結(jié)果] 當(dāng)溫度低于45 ℃時(shí)，枸杞多糖的溶出率隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，枸杞多糖的溶出率卻降低；隨著凍融次數(shù)的增多，枸杞多糖的溶出率逐漸增大，但超過3次以后溶出率提升并不明顯；隨著凍結(jié)時(shí)間的增長(zhǎng)，枸杞多糖的溶出率逐漸增大，當(dāng)凍結(jié)時(shí)間超過3 h后，枸杞多糖溶出率趨于平穩(wěn)，無明顯變化；隨著凍結(jié)溫度的降低，枸杞多糖的融出率逐漸增大，當(dāng)凍結(jié)溫度低于-24 ℃后，枸杞多糖融出率趨于平穩(wěn)，無明顯變化。[結(jié)論] 反復(fù)凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為：解凍溫度45 ℃，凍融次數(shù)4次，凍結(jié)時(shí)間3 h，凍結(jié)溫度-28 ℃。

枸杞多糖；反復(fù)凍融；溶出率；提取

枸杞既是傳統(tǒng)名貴中藥材，又是一種營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)品，市場(chǎng)上多以干品的形式進(jìn)行交易，枸杞多糖可以改善老年人易疲勞、食欲不振和視力模糊等癥狀[1-2]，并具有降血脂、降血糖[3-4]、抗脂肪肝、抗衰老、抗腫瘤等作用[5-6]，但是，純品提取繁雜，價(jià)格昂貴。枸杞多糖粗品較純品相比，提取簡(jiǎn)便，方便實(shí)驗(yàn)探究。反復(fù)凍融法是利用凍結(jié)—解凍過程中枸杞細(xì)胞內(nèi)部的冰晶體對(duì)細(xì)胞壁的機(jī)械作用而使其破裂的一種物理方法[7-8]，該法實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、環(huán)保，有利于保護(hù)多糖結(jié)構(gòu)，提高多糖的生物利用率[9]。反復(fù)凍融所需條件在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中比較容易獲得，為探究新的枸杞多糖提取方式，該文對(duì)反復(fù)凍融法與枸杞多糖溶出率之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備枸杞子，葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品)，苯酚(分析純)，硫酸(分析純)，石油醚(分析純)，電子天平，紫外-可見分光光度計(jì)(UVmini-1240)，水浴鍋，冰箱。

1.2方法

1.2.1樣品處理。取枸杞子干品0.1 g，置于小瓷杯中，加水1 mL，溶脹20 min后，置于冰箱冷凍室冷凍，一段時(shí)間后取出，放入水浴鍋中解凍20 min，將溶脹的枸杞與溶液一并倒入250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL石油醚在48 ℃水浴的情況下回流1 h，過濾，于分液漏斗中分液，棄去有機(jī)層，剩余溶液與枸杞一并倒入250 mL圓底燒瓶中，加水150 mL，98 ℃水浴回流2 h，靜置冷卻后取1 mL溶液滴入250 mL容量瓶中，定容[10-11]。

1.2.2多糖含量測(cè)定。使用苯酚—硫酸法測(cè)定多糖[12]。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取0.025 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于250 mL量瓶中，定容至刻線，搖勻，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.1 mg/mL)待用。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于試管中，各加入蒸餾水，使其體積為2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，并迅速滴加濃硫酸5.0 mL，充分振蕩搖勻之后靜置15 min后，40 ℃水浴15 min。另外以蒸餾水2.0 mL，加苯酚和濃硫酸同上述操作做空白對(duì)照，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2可溶性多糖溶出率的測(cè)定。 按“1.2.1”工藝處理樣品后，經(jīng)顯色，在490 nm下測(cè)定吸光值，可計(jì)算可溶性多糖的溶出率。

可溶性多糖溶出率=[可溶性多糖質(zhì)量(g)×稀釋倍數(shù)]/樣品質(zhì)量(g)×100%

={[(A+0.064 6)×51 250]/(1.298 3×106×M)}×100%

式中：A為吸光度，M為樣品質(zhì)量。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of glucose solution

2.2解凍溫度對(duì)枸杞多糖溶出率的影響共設(shè)5種解凍溫度處理，分別為30、45、60、75、90 ℃，在凍結(jié)時(shí)間1 h、凍結(jié)溫度-20 ℃，凍融1次的情況下實(shí)驗(yàn)，測(cè)得枸杞多糖溶出率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，解凍溫度對(duì)枸杞多糖的溶出率影響較為顯著。當(dāng)溫度低于45 ℃時(shí)，枸杞多糖的溶出率隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，枸杞多糖的溶出率卻降低了。分析認(rèn)為過高溫度易使枸杞多糖降解，而溫度不夠又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂不充分，可溶性多糖溶出率降低[13]。

圖2　解凍溫度對(duì)枸杞多糖溶出率的影響Fig.2　Effect of thawing temperature on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.3凍融次數(shù)對(duì)枸杞多糖溶出率的影響共設(shè)5種凍融次數(shù)處理，分別為1、2、3、4、5次，在凍結(jié)時(shí)間1 h，凍結(jié)溫度-20 ℃，解凍溫度30 ℃的情況下實(shí)驗(yàn)，測(cè)得枸杞多糖溶出率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著凍融次數(shù)的增多，枸杞多糖的溶出率逐漸增大，但超過3次以后溶出率提升并不明顯，分析認(rèn)為，枸杞細(xì)胞結(jié)構(gòu)經(jīng)過3次凍融后基本被破壞，故對(duì)溶出率無明顯影響。

圖3　凍融次數(shù)對(duì)枸杞多糖溶出率的影響Fig.3　Effects of freezing-thawing times on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.4凍結(jié)時(shí)間對(duì)枸杞多糖溶出率的影響共設(shè)6種凍結(jié)時(shí)間處理，分別為1、2、3、4、5、6 h，在凍結(jié)溫度-20 ℃，解凍溫度30 ℃，凍融1次的情況下實(shí)驗(yàn)，測(cè)得枸杞多糖溶出率，結(jié)果如圖4。由圖4可知，隨著凍結(jié)時(shí)間的增長(zhǎng)，枸杞多糖的溶出率逐漸增大。當(dāng)凍結(jié)時(shí)間超過3 h后，枸杞多糖溶出率趨于平穩(wěn)，無明顯變化。分析認(rèn)為，凍結(jié)3 h以上后，細(xì)胞內(nèi)冰晶增長(zhǎng)趨于飽和[14]，故對(duì)枸杞多糖溶出率無明顯影響。

圖4　凍結(jié)時(shí)間對(duì)枸杞多糖溶出率的影響Fig.4　Effect of freezing time on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.5凍結(jié)溫度對(duì)枸杞多糖溶出率的影響共設(shè)6種凍結(jié)溫度處理，分別為-20、-22、-24、-26、-28、-30 ℃，在凍結(jié)時(shí)間1 h，解凍溫度30 ℃，凍融1次的情況下實(shí)驗(yàn)，測(cè)得枸杞多糖溶出率，結(jié)果如圖5。由圖5可知，隨著凍結(jié)溫度的降低，枸杞多糖的融出率逐漸增大。當(dāng)凍結(jié)溫度低于-24 ℃后，枸杞多糖融出率趨于平穩(wěn)，無明顯變化。分析認(rèn)為，凍結(jié)溫度低于-24 ℃后，冰晶形成在細(xì)胞內(nèi)部的比值達(dá)到最大[15]，無法對(duì)細(xì)胞壁的破壞做更多貢獻(xiàn)，故枸杞多糖融出率趨于平穩(wěn)。

圖5　凍結(jié)溫度對(duì)枸杞多糖溶出率的影響Fig.5　Effects of freezing temperature on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.6正交實(shí)驗(yàn)為選擇反復(fù)凍融法對(duì)枸杞多糖最佳溶出工藝條件，設(shè)計(jì)以解凍溫度、凍融次數(shù)、凍結(jié)時(shí)間、凍結(jié)溫度為考察因素，以枸杞多糖的溶出率為考察目標(biāo)的L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見表1。經(jīng)過試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

以表3的方差分析為依據(jù)，選取凍結(jié)時(shí)間作為誤差估計(jì)項(xiàng)，研究結(jié)果表明，解凍溫度對(duì)枸杞多糖融出率有顯著影響。由表2可知，各因素對(duì)枸杞多糖融出率的影響是不同的，4個(gè)因素對(duì)枸杞多糖融出率的影響大小順序依次為：A>D>C>B。經(jīng)過極差分析發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為A2B3C2D3，即：解凍溫度45 ℃，凍融次數(shù)4次，凍結(jié)時(shí)間3 h，凍結(jié)溫度-28 ℃時(shí)，枸杞多糖融出率較高，在該工藝下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到3組數(shù)據(jù)：15.653%、15.644%、15.655%，驗(yàn)證的平均值為15.651%。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析

3　結(jié)論

(1)各因素對(duì)枸杞多糖溶出率的影響順序?yàn)椋航鈨鰷囟?凍結(jié)溫度>凍結(jié)時(shí)間>凍融次數(shù)。

(2)分析認(rèn)為，解凍溫度直接影響枸杞多糖的結(jié)構(gòu)完整性，故解凍溫度為主要影響因素。凍結(jié)溫度雖然不會(huì)破壞枸杞多糖的結(jié)構(gòu)，但直接影響冰晶的大小；凍結(jié)時(shí)間決定冰晶的數(shù)量，但低溫凍結(jié)生成的小冰晶對(duì)細(xì)胞壁破壞貢獻(xiàn)低，數(shù)量不足以彌補(bǔ)大小帶來的差距；凍融次數(shù)雖然越多越好，但多次凍融耗費(fèi)時(shí)間，貢獻(xiàn)小，得不償失。

(3)反復(fù)凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合是：解凍溫度45 ℃，凍融次數(shù)4次，凍結(jié)時(shí)間3 h，凍結(jié)溫度-28 ℃，在該條件下，枸杞多糖融出率可達(dá)到15.651%。

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Technique of Extracting Polysaccharides from Goji Berry by Repeated Freezing and Thawing Method

WEN Zi-chen ,RONG Xue, GUO Nai-fei*et al

(College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian, Liaoning 116600)

[Objective] To study the effects of repeated freezing and thawing method on rate of extracting polysaccharides from Goji Berry. [Methods] Single factor experiment and orthogonal test were carried out for thawing temperature, freezing time, freezing and thawing times, and freezing temperature, to verify the effects of repeated freezing and thawing method on rate of extracting polysaccharides from Goji Berry. [Results] When the temperature was lower than 45 ℃, the dissolving rate of polysaccharides increases with temperature rise; when the temperature is higher than 45 ℃, the dissolving rate of polysaccharides drops; with increase in freezing-thawing times, the increase of dissolving rate of polysaccharides is slight when the freezing time exceeds 3 h; with increase in the freezing time, the dissolving rate of polysaccharides gradually increases, but when the freezing time exceeds 3 h, the dissolving rate of polysaccharides tends to become steady; when the freezing temperature drops, the dissolving rate of polysaccharides gradually rises, but when the temperature is lower than -42 ℃, the dissolving rate of polysaccharides tends to become steady. [Conclusion] The optimal process combination of repeated freezing and thawing method for extracting polysaccharides from Goji Berry is as follows: 45 ℃ for thawing temperature, 4 for repeated times; 3 h for freezing time; -28 ℃ for freezing temperature.

Goji Berry polysaccharides; Repeated freezing and thawing method; Dissolving rate; Extraction

遼寧省2014省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(20141016-2000035)。

溫梓辰(1996- )，男，湖南長(zhǎng)沙人，本科生，專業(yè)：藥學(xué)。*通訊作者，講師，博士，從事食品質(zhì)量與安全研究。

2016-05-26

S 567.1+9

A

0517-6611(2016)19-111-03