孫建琴　陳紅英　姚忠紅　穆敬平　郭俐宏（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

?

電針配合威靈仙關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎MMPs及HA的影響*

孫建琴陳紅英姚忠紅穆敬平△郭俐宏
（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

目的 探討電針配合威靈仙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及關(guān)節(jié)液透明質(zhì)酸（HA）影響的作用機制。方法 將40只大鼠隨機分為對照組、電針組、關(guān)節(jié)腔注射組、電針+關(guān)節(jié)腔注射組，采用膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射弗氏劑的方法建立膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型；電針組取三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉及主穴以下旁開0.5 cm為配穴電針刺激20 min，關(guān)節(jié)腔注射組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射威靈仙注射液；電針+關(guān)節(jié)腔注射組治療方法為電針+關(guān)節(jié)腔注射；觀察膝關(guān)節(jié)腫脹率及消腫時間，采用酶免疫吸附試驗測定血清MMPs（MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13）陽性表達水平，關(guān)節(jié)腔積液中白介素（IL-1β）、HA含量。結(jié)果 與電針組及關(guān)節(jié)腔注射組比較，電針+關(guān)節(jié)腔注射組膝關(guān)節(jié)腫脹率、消腫時間、MMP-1、MMP-9表達水平明顯降低，HA明顯提高（P＜0.05）。結(jié)論 電針配合威靈仙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機制可能與抑制MMPs過度表達并增加HA分泌而促進局部炎癥吸收，延緩關(guān)節(jié)軟骨退行性變相關(guān)。

膝骨關(guān)節(jié)炎電針關(guān)節(jié)腔注射威靈仙基質(zhì)金屬蛋白酶透明質(zhì)酸

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）屬中醫(yī)學(xué)“筋痹”“骨痹”范疇。中醫(yī)學(xué)認為膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病與血瘀氣滯、關(guān)節(jié)局部濕濁痹阻有關(guān)。外傷、關(guān)節(jié)滑膜勞損、感染等炎性及疼痛刺激使膝骨關(guān)節(jié)面滑膜毛細血管擴張、通透性增大而導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織液大量滲出而成關(guān)節(jié)積液［1］。以往治療時多局限于“舒筋通絡(luò)、除痹利濕、行氣止痛、活血化瘀”［2］。本實驗研究采取電針配合威靈仙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的方法治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎，研究該方案對造成膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛的病理基礎(chǔ)，即MMP陽性表達及HA分泌與炎性疼痛的相互關(guān)系，分析治療膝骨關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛消炎作用機制，為臨床提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組SP F級無特定病原體動物SD大鼠40只，體質(zhì)量（200.0±20.0）g，雌雄各半，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2014-0008，實驗動物設(shè)施使用許可證：SYXK（鄂）2014-0031。采用隨機數(shù)字表編號，隨機分為對照組、電針組、關(guān)節(jié)腔注射組及電針+關(guān)節(jié)腔注射組，每組10只。

1.2試藥與儀器復(fù)方威靈仙注射液（太和醫(yī)院藥劑科制劑中心提供），藥方：威靈仙1000 g，獨活500 g，柴胡500 g，白芷500 g，川芎500 g，氯化鈉8 g，亞硫酸氫鈉1 g。弗氏完全佐劑（上海實生細胞生物技術(shù)有限公司）；MMPs測試盒 （上海森雄科技實業(yè)有限公司）；SDZ-Ⅱ型電子針療儀（上海坤弘，型號：SDZ-Ⅱ）。

1.3模型制備碘伏消毒大鼠膝關(guān)節(jié)及以下部位，采用改良Huhh造模法制備膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型［3］。造模時于第1、3、7日分別將弗氏完全佐劑0.1 mL注入大鼠右膝關(guān)節(jié)腔，根據(jù)臨床超疲勞易導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的特點，強迫動物每日活動30～40 min，于2周后出現(xiàn)以下癥狀即可確定大鼠膝關(guān)節(jié)炎模型成功：1）關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛癥狀，有右膝軟組織腫脹或關(guān)節(jié)腔積液現(xiàn)象；2）右膝關(guān)節(jié)活動受限、周圍僵硬；3）發(fā)病部位在膝等關(guān)節(jié)；4）關(guān)節(jié)積液檢查白細胞介素-1β降低、HA明顯升高現(xiàn)相；5）關(guān)節(jié)病理切片顯示關(guān)節(jié)軟骨面粗糙、滑膜增生、粘連、肥厚；6）出現(xiàn)以上任意3條均可判定為膝骨關(guān)節(jié)炎。

1.4治療方法1）電針組：將大鼠固定于大鼠固定器，右膝遁經(jīng)取穴，三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉為主穴。針法：由內(nèi)向外斜刺2～3分。主穴以下旁開0.5 cm為配穴，行導(dǎo)氣手法用一次性無菌針灸針齊刺入骨膜，以三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉為正極，配穴為負極，得氣后接 SDZ-II型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針電針刺激20 min。2）關(guān)節(jié)腔注射組：于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射威靈仙注射液，每日1次，每次0.1～0.2 mL。3）電針+關(guān)節(jié)腔注射組：先同電針組相同治療完成后，于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射威靈仙注射液。4）對照組：大鼠每日僅消毒處理作為對照。以上4組動物治療2周為1個療程。

1.5標(biāo)本采集及檢測參考文獻［4］，大鼠眼眶靜脈取血，采用免疫酶連吸附試驗 （ELISA）測定MMPs （MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13）血清中的表達水平；抽取膝關(guān)節(jié)腔關(guān)節(jié)積液備用，測定關(guān)節(jié)積液中IL-1β、HA含量。按文獻［5］方法：先取100 mL量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用50 mL注射器吸取量筒內(nèi)蒸餾水約30 mL。于每只大鼠右前肢膝關(guān)節(jié)縫矢狀面用記號筆做一標(biāo)記，然后把大鼠左足緩慢伸入量筒內(nèi)，使標(biāo)記與量筒最高處平齊。再用已吸入30 mL水的注射器向量筒內(nèi)緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)記處一致，讀取注射器內(nèi)剩余液體體積，再用30 mL注射器內(nèi)剩余液體體積即為大鼠的右前肢膝關(guān)節(jié)容積，重復(fù)3次取平均值。右前肢膝關(guān)節(jié)腫脹百分率（%）=（造模后容積-造模前容積）/造模前容積×100%。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間差異采用Dunnett檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組動物足腫脹度及消腫時間見表1。治療后電針組、關(guān)節(jié)腔注射組足腫脹度及消腫時間均低于本組治療前及對照組（P＜0.05），但兩組治療后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。電針+關(guān)節(jié)腔注射組足腫脹度及消腫時間明顯低于電針組及關(guān)節(jié)腔注射組 （P＜0.05）。

表1　各組大鼠足腫脹度及消腫時間比較（±s）

表1　各組大鼠足腫脹度及消腫時間比較（±s）

與本組治療前比較，△P＜0.05；與對照組治療后比較，▲P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05；與關(guān)節(jié)腔注射組比較，*P＜0.05。下同。

組別　n　消腫時間（d）足腫脹度（%）治療前　治療后對照組　10　45.92±3.90 34.21±3.32　13.79±4.78電針組　10　10.33±2.32△▲關(guān)節(jié)腔注射組　10　8.54±2.21△▲#47.41±4.33 28.34±3.17△▲48.29±3.88 16.39±2.47△▲#電針+關(guān)節(jié)腔注射組　10　6.34±1.49#*46.27±4.03 10.30±1.36#*

2.2各組動物治療前后IL-1β及HA表達水平比較見表2。電針組HA有一定的升高，IL-1β有降低趨勢，但與本組治療前及對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），關(guān)節(jié)腔注射組IL-1β明顯降低，HA明顯升高（P＜0.05）；與電針組及關(guān)節(jié)腔注射組比較，電針+關(guān)節(jié)腔注射組IL-1β明顯降低，HA明顯升高（P＜0.05）。

表2　各組治療前后大鼠HA、IL-1β表達水平比較（±s）

表2　各組治療前后大鼠HA、IL-1β表達水平比較（±s）

組　別　時間　HA（μg/L）　IL-1β（pg/mL）對照組　治療前　1.72±0.35　41.28±5.30 （n=10）　治療后　1.93±0.27　42.50±5.22電針組　治療前　1.68±0.25　39.89±4.53 （n=10）　治療后　1.89±0.24　37.31±3.49關(guān)節(jié)腔注射組　治療前　1.70±0.34　41.45±5.20 （n=10）　治療后　0.72±0.09△▲#20.34±2.40△▲#電針+關(guān)節(jié)腔注射組　治療前　1.68±0.37　40.73±5.24 （n=10）　治療后　0.49±0.06#*　13.34±1.47#*

2.3各組動物治療前后MMPs表達水平比較見表3。對照組大鼠血清MMPs各指標(biāo)治療后仍保持在較高水平，與對照組及治療前比較，電針組及關(guān)節(jié)腔注射組MMP-1、MMP-9表達水平均降低（P＜0.05）。電針+關(guān)節(jié)腔注射組MMP-2、MMP-3、MMP-13均有一定程度降低，但與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。MMP-1、MMP-9表達水平則顯著降低，與電針組及關(guān)節(jié)腔注射組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組治療前后大鼠MMPs表達水平比較（ng/L，±s）

表3　各組治療前后大鼠MMPs表達水平比較（ng/L，±s）

MMP-10　MMP-13 65.67±5.34 81.31±7.81 61.52±5.39 78.27±7.24 63.65±5.37 82.20±8.02 （n=10）　治療后　76.±6.82△▲　78.9±7.32 60.7±5.39　53.7±5.02△▲　59.2±4.29　79.2±7.29關(guān)節(jié)腔注射組　治療前　92.70±8.21　79.21±6.84 61.79±5.57 76.10±7.62　65.01±5.37 80.73±7.71 （n=10）　治療后　70.80±6.81△#▲75.22±6.31 58.30±4.92 44.87±3.68△#▲61.74±5.12 77.27±6.21電針+關(guān)節(jié)腔注射組　治療前　91.52±8.72　80.27±7.21 63.27±5.27 77.20±7.42　63.54±5.98 82.79±7.28 （n=10）　治療后　52.81±4.82#*76.20±6.97 59.60±4.29 35.30±2.74#*59.79±5.34 78.27±7.02組別　時間對照組　治療前（n=10）　治療后電針組　治療前MMP-1　MMP-2　MMP-3 93.28±8.76　80.21±7.17 62.72±5.45 89.34±8.07　76.25±6.19 59.35±5.24 94.78±8.87　81.21±7.84 63.79±5.52 MMP-9 79.17±7.62 76.02±6.81 77.10±6.67

3　討　論

威靈仙注射液由毛莨科植物威靈仙干燥根及根莖，經(jīng)加工提取的滅菌溶液，內(nèi)含常春藤皂苷元及齊墩果酸等成分，具有消炎抑菌、清熱解毒、強心利尿之功效［6］?！侗静菥V目》記載威靈仙“味微辛咸、通經(jīng)絡(luò)、消痰涎、祛風(fēng)濕、散癖積，藥性辛散溫通，通行十二經(jīng)脈，既能祛風(fēng)濕，又能通經(jīng)止痹痛”［7］。膝骨關(guān)節(jié)炎常出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液，其病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)腔及滑膜炎性浸潤，造成關(guān)節(jié)面軟骨被破壞、變性并繼發(fā)滑液炎癥，是關(guān)節(jié)軟骨細胞的分解與合成代謝紊亂造成的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病［8］。臨床上多發(fā)于35歲以上的中年人，臨床以膝關(guān)節(jié)疼痛、變形和活動受限為主要特點，目前治療辦法多以抗炎消腫為主，但療效并不理想［9］。中醫(yī)學(xué)認為，當(dāng)膝關(guān)節(jié)因外傷或其他原因受損傷后，局部關(guān)節(jié)血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，針灸治療當(dāng)以舒筋通絡(luò)、行氣止痛，中藥內(nèi)服外敷治療當(dāng)以活血化瘀、利濕除痹而達到臨床治愈的目的［10］。

研究表明，軟骨細胞外MMPs的病理性降解可導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生［11］，MMPs有20多種，但在膝骨關(guān)節(jié)炎病理改變則以MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13表達異常增高為主，其中MMP-1、MMP-9是胞外基質(zhì)降解的主要蛋白水解系統(tǒng)［12］，MMP-1、MMP-9與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生密切相關(guān)［13］，同時，正常的骨關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1β，當(dāng)膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時IL-1β則會異常增高。HA可減少膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)PGE2等炎性介質(zhì)的合成及擴散，減少滑膜的通透性及關(guān)節(jié)內(nèi)滲液［14］。故本實驗研究以MMPs、IL-1β、HA等主要指標(biāo)評價電針配合威靈仙注射液治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的影響。

本實驗中選用三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉等諸穴，是因為陽陵泉可強筋祛濕，主治膝痹；足三里具有養(yǎng)血益氣之功效，主治下肢痿痹；而血海穴主活血，與陽陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡(luò)、利通關(guān)節(jié)之奇效［15］。實驗數(shù)據(jù)顯示，電針+關(guān)節(jié)腔注射組大鼠MMP-1、MMP-9表達水平、IL-1β及左足趾關(guān)節(jié)腫脹率明顯降低，消腫時間明顯低于電針組、關(guān)節(jié)腔注射組。這可能與電針刺激可激發(fā)經(jīng)氣，促進局部血液循環(huán)及局部病變組織新陳代謝，降低痛閾、減輕關(guān)節(jié)滑膜表面神經(jīng)末梢對炎性因子IL-1β刺激的反應(yīng)敏感度有關(guān)，故其關(guān)節(jié)腫脹率明顯降低，消腫時間縮短。電針+關(guān)節(jié)腔注射組HA較單用電針刺激及威靈仙關(guān)節(jié)腔注射組增高明顯，IL-1β進一步降低，這可能是威靈仙吸收后明顯抑制MMP-1MMP-9產(chǎn)生，促使滑膜內(nèi)襯B型滑膜細胞和單核吞噬細胞大量分泌HA，達到潤滑關(guān)節(jié)、延緩軟骨退變及保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。MMP-1、MMP-9產(chǎn)生降低可減輕MMPs對關(guān)節(jié)組織細胞外基質(zhì)降解，減輕IL-1β對關(guān)節(jié)表面軟骨細胞的破壞作用。

綜上所述，電針刺激配合威靈仙注射液膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎有明確的治療作用，促進局部組織血液循環(huán)及新陳代謝，明顯降低MMP-1、MMP-9對關(guān)節(jié)組織細胞外基質(zhì)降解及IL-1β對膝關(guān)節(jié)的破壞，延緩關(guān)節(jié)軟骨退行性變，提高大鼠對炎癥因子IL-1β等刺激的痛閾，增加HA對膝關(guān)節(jié)潤滑及保護作用。

［1］唐瑭，陳德森，李莉，等.通痹外敷膏聯(lián)合關(guān)節(jié)腔沖洗治療膝骨性關(guān)節(jié)炎合并積液的臨床研究［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2014，3（11）：213-216.

［2］張拴平，郝陽泉.關(guān)節(jié)內(nèi)灌注沖洗并中藥熏洗治療膝骨性關(guān)節(jié)炎50例［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，33（5）：68.

［3］劉獻祥，李西海，周江濤，等.改良Huhh造模法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25 （12）：1104-1106.

［4］王國金，衛(wèi)小春，張志強，等.血清和關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶-3及其抑制因子-1的檢測及臨床意義［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，10（5）：311-315.

［5］姚俊巖，安靚，王巖，等.骨關(guān)節(jié)炎患者血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、-9的明膠酶譜 ［J］.分析生物技術(shù)通訊，2003，14 （3）：188-189.

［6］周效思，周凱，譚安雄，等.威靈仙對大鼠膝膝骨關(guān)節(jié)炎結(jié)構(gòu)和功能的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（10）：2454-2457.

［7］李增華.威靈仙考證探析［J］.中醫(yī)中藥，2007，45（20）：62-63.

［8］李特，李運曼，劉麗芳，等.威靈仙總皂苷抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，40（2）：157-160.

［9］鐘琴，劉正奇，安陽，等．苗藥痛風(fēng)停湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型日本大耳白大鼠血清IL-8的影響［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2014，21（1）：16-18.

［10］陳才興，孫成長.中藥內(nèi)外兼治合透明質(zhì)酸鈉治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，16（7）：427-428.

［11］Kanynam M，Kuboki T，Kojima S，et al．Matrix metalloproteinaseks and tissue inhibitors of metalloproteinases in synovial luids of patients with temporo-mandibular joint osteoarthritis［J］．J Orefacial Pain，2000，14（12）：20-23．

［12］麻圣達，盧雄，羅利飛，等．玻璃酸鈉對膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶-3、9水平的影響及療效觀察［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（1）：42-44.

［13］Mizui T，Ishimaru JI，Miyamoto K，et al.Matrix mettdloproteinase-2 in synovial lavage fluid of patients with disorders of the tempommandibular joint［J］．Br J Oral Maxi Hohc Surg，2001，39（37）：310-311.

［14］李敏，丁武華，李莉，等.電針后外敷威靈仙浸膏治療日本大耳白兔實驗性膝骨關(guān)節(jié)炎的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，24（13）：1394-1396.

［15］周效思，周凱．威靈仙水提取液的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6（11）：39-40．

Experimental Study on Effects of Electroacupuncture Combined with Weilingxian Intra-articular Injection on MMPs and HA in Rats with Knee Osteoarthritis

SUN Jianqin，CHEN Hongying，YAO Zhonghong，et al.Taihe Hospital of Shiyan，Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine，Hubei，Shiyan 442000，China.

【Abstract】Objective：To investigate the effect and mechanism of electro acupuncture combined with Weilingxian intra-articular injection on MMPs and HA in rats with knee osteoarthritis.Methods：40 rats were randomly divided into the control group，electroacupuncture group，Weilingxian group，electroacupuncture plus acupoint injection group.Osteoarthritis animal model was established with the method of intra articular injection of the knee joint.Electroacupuncture group took electroacupuncture below 0.5 cm of Zusanli，Sanyinjiao and Xingjian，Xuehai，Taichong，Yang Ling Quan and the main points for 20 minutes.Weilingxian group took intra-articular injection of Weilingxian.Electroacupuncture plus acupoint injection group received both treatment above.The knee swelling rate and joint swelling time were observed，and the following data was determined by enzyme-linked immunosorbent assay：positive expression level of serum MMPs（MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，MMP-13），IL-1β in articular effusion and the content of HA.Results：Knee joint swelling rate，swelling time of MMP-1，MMP-9 expression levels in electroacupuncture plus point injection group were significantly lower than those of Weilingxian group，and HA was obviously improved（P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of electroacupuncture combined with knee intra-articular injection of Weilingxian on knee osteoarthritis in rats should be related to the inhibition of overexpression of MMPs and the increase the secretion of HA，so as to promote inflammation absorption and delay cartilage degenerative change.

Kneeosteoarthritis；Acupuncture；Acupointinjection；Weilingxian；Matrixmetalloproteinases；Hyaluronic acid

R245.9+7

A

1004-745X（2016）05-0791-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.012

湖北省科技廳項目（2013cfc037）
△

（電子郵箱：2051494669@qq.com）

2016-01-09）