李　梅，王耀帥，王應(yīng)越南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210023

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溫和灸對(duì)大鼠后三里穴局部形態(tài)及CGRP、SP、VIP表達(dá)的影響*

李梅，王耀帥△，王應(yīng)越
南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210023

目的：探討溫和灸對(duì)大鼠后三里穴施灸局部的溫通效應(yīng)及生物學(xué)基礎(chǔ)。方法：以高脂血癥模型大鼠后三里穴為觀察對(duì)象，運(yùn)用HE染色法和免疫組化法，觀察溫和灸熱刺激下，后三里穴局部皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)以及皮膚組織中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）表達(dá)的變化。結(jié)果：溫和灸組與對(duì)照組比較，后三里穴局部皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生變化，角化層極薄或消失，表皮層斷裂不完整，真皮層膠原纖維排列疏松；施灸后穴位局部皮膚CGRP較多表達(dá)在真皮層結(jié)締組織，SP較多表達(dá)在毛囊，VIP較多表達(dá)在真皮層結(jié)締組織以及表皮中。結(jié)論：溫和灸熱刺激可以改變后三里穴局部形態(tài)結(jié)構(gòu)、影響后三里穴局部皮膚中CGRP、SP、VIP的分布表達(dá)，這些效應(yīng)可能與艾灸以溫促通的生物學(xué)基礎(chǔ)相關(guān)。

溫和灸；后三里；降鈣素基因相關(guān)肽；P物質(zhì)；血管活性腸肽

艾灸是以艾為主要材料，點(diǎn)燃后在體表穴位或病變部位燒灼、溫熨，借助其溫?zé)岽碳ぷ饔?，起到溫通氣血、扶正祛邪等防病保健的功效?-3］。體表皮膚是艾灸刺激的直接作用部位，局部皮膚適宜溫?zé)岽碳さ倪x擇、刺激的反應(yīng)特征及啟動(dòng)相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的過(guò)程均以皮膚的生物學(xué)特征為基礎(chǔ)，也就是說(shuō)研究艾灸的效應(yīng)規(guī)律和作用原理，并不是只研究艾灸本身的特征，還要研究它的作用對(duì)象的特征。本研究以高脂血癥大鼠為模型，觀察溫和灸熱刺激對(duì)后三里穴施灸局部皮膚的形態(tài)，以及局部皮膚降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）等神經(jīng)肽陽(yáng)性表達(dá)的影響，探討溫和灸局部的溫通效應(yīng)及以溫促通作用的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180± 10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（清潔級(jí)），采取高脂飼料喂養(yǎng)8周，造成高脂血癥大鼠模型。

1.2實(shí)驗(yàn)器材定制直徑7 mm動(dòng)物用清艾灸條（南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司）、液狀石蠟、中性樹(shù)膠（均由上海標(biāo)本模型廠提供）、甲醛、二甲苯、無(wú)水乙醇（均由南京寧試化學(xué)試劑有限公司提供）、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑盒（均由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供）、兔抗大鼠CGRP多克隆抗體、兔抗大鼠SP多克隆抗體、兔抗大鼠VIP多克隆抗體（均由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供）。TP1020型全自動(dòng)組織處理儀（由德國(guó)LEICA公司提供）、RM2145型石蠟切片機(jī)（由德國(guó)LEICA公司提供）、BX60型光學(xué)顯微鏡（由日本OLYMPUS公司提供）、DP71型圖像獲取系統(tǒng)（由日本OLYMPUS公司提供）、CMIAS98A型圖像分析儀（由北京航空航天大學(xué)提供）、圖像分析軟件（由南京大學(xué)捷達(dá)公司提供）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組將造模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和溫和灸干預(yù)組，每組8只。

1.3.2干預(yù)方法造模成功后，溫和灸組大鼠施以10 min/d，共2周的溫和灸治療。將大鼠雙側(cè)后三里穴區(qū)1 cm×2 cm鼠毛剪除，暴露局部皮膚組織，酒精棉球消毒。用自制固定夾仰臥位固定大鼠，待大鼠安靜不掙扎后，使用直徑7 mm的艾條，以大鼠無(wú)掙扎行為的距離調(diào)節(jié)艾條與皮膚的距離，施灸于后三里穴進(jìn)行治療。后三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5mm處［1］。治療期間，對(duì)照組以同樣方法抓取固定，不做艾灸治療。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠同等條件下喂養(yǎng)。

1.3.3HE染色及免疫組化完成治療后，禁食12小時(shí)后，取血、取材。取大鼠后三里穴局部長(zhǎng)8 mm、寬6 mm、厚3 mm的組織，使標(biāo)記點(diǎn)在正中間，用預(yù)冷的4℃生理鹽水沖洗后，放入10%甲醛中固定。將固定好的皮膚組織進(jìn)行修塊石蠟包埋。HE染色：石蠟切片脫蠟脫水；蘇木素染液染色5分鐘；快速放入1%鹽酸乙醇中進(jìn)行分化；用清水洗滌后，放入促反藍(lán)液中10分鐘；返藍(lán)結(jié)束后，梯度酒精上行脫水；二甲苯透明；樹(shù)膠封片。免疫組化：取石蠟切片，置烤箱60℃2小時(shí)以使切片緊密黏附。二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，PBS洗，3分鐘×3次；3%H2O2室溫孵育10分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；檸檬酸鹽抗原修復(fù)液室溫孵育20分鐘；滴加5%BSA封閉液，室溫10分鐘，甩去多余液體，不洗；滴加兔抗鼠CGRP（SP、VIP）多克隆抗體，置37℃溫箱孵育1.5小時(shí)。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔IgG，置37℃溫箱孵育45分鐘；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；DAB顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.3.4圖像采集指標(biāo)觀測(cè)用光學(xué)顯微鏡觀察玻片上組織的形態(tài)，找到有效信息，CGRP、SP、VIP陽(yáng)性顯色為棕黃色或棕褐色顆粒，再用攝像儀進(jìn)行圖像的拍攝，拍攝倍數(shù)為10×10，然后用圖像分析儀及形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)將獲取的圖像信息進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果

2.1H E染色對(duì)照組后三里穴位局部角化層薄，表皮結(jié)構(gòu)完整，基底層、棘層以及顆粒細(xì)胞層都未見(jiàn)異常改變，連續(xù)真皮層結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維束排列致密，染色呈鮮明紅色，其間可見(jiàn)毛囊、皮脂腺分布，皮下組織結(jié)構(gòu)正常（圖1A）。溫和灸組施灸局部皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生變化，角化層極薄或消失，表皮層斷裂不完整，真皮層膠原纖維排列疏松（圖1B）。

圖1　后三里穴局部皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，×100）

2.2免疫組化CGRP、SP、VIP陽(yáng)性顯色為棕黃色或棕褐色顆粒，信號(hào)越強(qiáng)則顏色越深。對(duì)照組皮膚組織中可見(jiàn)CGRP表達(dá)，溫和灸組CGRP主要表達(dá)在真皮層結(jié)締組織；對(duì)照組皮膚組織中可見(jiàn)SP表達(dá)，溫和灸組SP主要表達(dá)在毛囊；對(duì)照組皮膚組織中可見(jiàn)VIP表達(dá)，溫和灸組VIP主要表達(dá)在真皮層結(jié)締組織，表皮層也有表達(dá)，見(jiàn)圖2-4。

圖2　后三里穴局部皮膚CGRP表達(dá)結(jié)果（免疫組化，×100）

圖3　后三里穴局部皮膚SP表達(dá)結(jié)果（免疫組化，×100）

圖4　后三里穴局部皮膚VIP表達(dá)結(jié)果（免疫組化，×100）

3　討論

在艾灸治療的過(guò)程中，溫度是重要的生物物理因素之一［4-6］。艾灸燃燒時(shí)產(chǎn)生的熱量通過(guò)腧穴局部傳入體內(nèi)，溫通效應(yīng)不僅涉及到表皮，還影響到皮下和肌層。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，溫和灸的熱刺激對(duì)施灸局部的溫通效應(yīng)體現(xiàn)在改變了施灸穴位局部皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)影響了皮膚組織內(nèi)的CGRP、SP、VIP等生物活性物質(zhì)的分泌和表達(dá)，這對(duì)于研究針灸刺激體表啟動(dòng)靶器官效應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制有重要意義。基于皮膚的神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌的相關(guān)生物學(xué)新知識(shí)［7-10］，為研究艾灸以溫促通作用機(jī)制的生物學(xué)基礎(chǔ)提供了啟示。艾灸的溫通作用可以引發(fā)局部的神經(jīng)源性炎癥，而神經(jīng)源性炎癥發(fā)病過(guò)程中的重要介質(zhì)包括興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如速激肽（如P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)為VIP、一氧化氮（NO）等。有報(bào)道［11］指出SP是神經(jīng)源性炎癥的生物標(biāo)志物，是觸發(fā)神經(jīng)源性炎癥的重要物質(zhì)。SP具有傳遞皮膚感覺(jué)信息、擴(kuò)張血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘發(fā)局部炎性作用及影響免疫系統(tǒng)等功能。SP激發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)，最終可能使局部炎癥通過(guò)神經(jīng)機(jī)制的介導(dǎo)而擴(kuò)展［12］。肥大細(xì)胞自身能分泌SP，釋放出的SP，又可促使肥大細(xì)胞進(jìn)一步釋放出大量的炎癥介質(zhì)，形成正反饋調(diào)節(jié)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。CGRP的外周生物學(xué)作用廣泛，是已知最強(qiáng)烈的血管舒張劑。CGRP可抑制SP酶的降解過(guò)程，同時(shí)也促進(jìn)SP從初級(jí)傳入纖維末梢的釋放。所以，CGRP可通過(guò)增強(qiáng)SP的生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在皮膚，VIP能直接影響血管功能的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)血管舒張和擴(kuò)散，同時(shí)能引起在傷口愈合中起重要作用的膠質(zhì)形成細(xì)胞。VIP可以通過(guò)從肥大細(xì)胞釋放的組胺和緩激肽誘導(dǎo)的水腫來(lái)參加神經(jīng)源性炎癥。肥大細(xì)胞是神經(jīng)內(nèi)分泌肽的重要靶細(xì)胞，在某些組織中，肽能神經(jīng)纖維和肥大細(xì)胞在解剖學(xué)上緊密相連。刺激神經(jīng)纖維，可以經(jīng)肥大細(xì)胞介導(dǎo)放大炎癥反應(yīng)。多種神經(jīng)內(nèi)分泌肽，如SP、VIP均能與其受體結(jié)合，活化肥大細(xì)胞，引起肥大細(xì)胞的脫顆粒及組胺的釋放。艾灸引發(fā)局部的神經(jīng)源性炎癥，對(duì)皮膚神經(jīng)肽、肥大細(xì)胞以及與瞬時(shí)感受器電位（TRP）家族的影響，可能是艾灸以溫促通作用機(jī)制的生物學(xué)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步深入研究。

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Effects of Mild Moxibustion on the Local Morphology of HouSanLi Points and the Expressions of CGRP，SP and VIP in Rats

LI Mei，WANG Yaoshuai△，WANG Yingyue
The Second Clinical School of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China

Objective：To study the warming effects of the mild moxibustion on HouSanLi points of the rats and its biological basis.Methods：HouSanLi points of the hyperlipidemia rat models were observed.HE staining and immunohistochemical methods were adopted to observe the local skin morphological structure of HouSanLi points，expression changes of calcitonin gene-related peptide（CGRP），substance P（SP）and vasoactive intestinal polypeptide（VIP）in skin tissues under the stimulating of the mild moxibustion.Results：when mild moxibustion group was compared with the control group，local skin morphological structure of HouSanLi points changed obviously，cutinized layer became thin or disappeared，the epidermis layer was not complete and dermis collagen fibers were in loose arrangement；the expression of CGRP in acupoint local skin appeared in dermal connective tissue more after the moxibustion，SP more expressed in hair follicles and VIP expression in the dermis of connective tissue and epidermis.Conclusions：Heat stimulating of the mild moxibustion can change the local morphological structure of Hou－SanLi points and affect the expressions of CGRP，SP and VIP in the local skin of HouSanLi points.And the effects above may be related to the biological basis of the warming effect of moxibustion.

mild moxibustion；HouSanLi；CGRP；SP；VIP

R285.5

A

1004-6852（2016）06-0007-03

2015-12-23

南京中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金預(yù)研項(xiàng)目（編號(hào)13XYYZ6）。

李梅（1987—），女，碩士學(xué)位。研究方向：針灸治療神經(jīng)內(nèi)分泌疾病的效應(yīng)研究。

△王耀帥（1983—），男，博士學(xué)位，講師。研究方向：針灸治療神經(jīng)內(nèi)分泌疾病的效應(yīng)研究。