曾發(fā)姣，舒 燕，繆 東，胡新旭，曾 艷

pColdTMTF載體原核表達(dá)FocA可溶性蛋白的研究

曾發(fā)姣，舒 燕，繆 東，胡新旭，曾 艷

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

為了較好地表達(dá)和純化尿道致病性大腸桿菌F1C菌毛主要亞單位FocA蛋白，研究以pColdTMTF為載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中原核表達(dá)F1C菌毛主要亞單位FocA，驗(yàn)證表達(dá)的蛋白是否為可溶性蛋白，并對(duì)focA基因表達(dá)的最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：目的基因focA在pCold表達(dá)系統(tǒng)中于15℃下誘導(dǎo)24 h蛋白表達(dá)量最高，IPTG濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)都能表達(dá)目的基因，且不同濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異；表達(dá)出來(lái)的FocA蛋白為可溶性蛋白。

大腸桿菌；F1C菌毛；FocA；原核表達(dá)

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.07.004

菌毛能夠介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)特異性宿主細(xì)胞的粘附，這對(duì)細(xì)菌感染和定植具有重要意義［1］。尿道致病性大腸桿菌是引起人類(lèi)泌尿器官感染的大腸桿菌的總稱(chēng)。尿道致病性大腸桿菌菌毛依其血凝特性可以分為3類(lèi)：第一類(lèi)是對(duì)人紅細(xì)胞凝集具有甘露糖抗性，如P、M、S菌毛［2］；第二類(lèi)是對(duì)豚鼠紅細(xì)胞凝集具有甘露糖敏感性，如1型菌毛［3］；第三類(lèi)菌毛不具有血凝特性，如F1C菌毛。雖然F1C菌毛不具有血凝特性，但它在尿道致病性大腸桿菌粘附過(guò)程中是有一定的作用的。Virkola等研究表明F1C菌毛能夠特異性粘附人腎集合管和遠(yuǎn)端小管。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與形成F1C菌毛的foc基因簇包括6個(gè)基因：focA、focC、focD、focG、focH和focI。其中，focA編碼主要菌毛亞單位，大小約為17 kD。F1C菌毛由大約1 000個(gè)主要結(jié)構(gòu)亞單位—FocA蛋白聚合在細(xì)菌表面而成。

重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)一般可以分為可溶性表達(dá)和非可溶性表達(dá)。根據(jù)重組蛋白表達(dá)場(chǎng)所不同，可溶性表達(dá)又包括細(xì)胞外可溶性表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)。非可溶性表達(dá)都是指的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為包涵體［4］。因目的外源基因在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)之后，雖然存在于細(xì)胞質(zhì)中，但往往是以包涵體的形式存在，無(wú)糖基，沒(méi)有生物活性［5-7］。雖然形成的包涵體可有效的避免表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌蛋白酶所降解和表達(dá)的重組蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性作用，但要對(duì)包涵體進(jìn)行分離純化，需要對(duì)包涵體進(jìn)行變復(fù)性處理。且包涵體溶解、復(fù)性是個(gè)問(wèn)題，而且復(fù)性后，其蛋白活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如天然蛋白活性。針對(duì)在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白時(shí)容易遇到的問(wèn)題，我們嘗試運(yùn)用高效冷凍表達(dá)載體pColdTMTF載體來(lái)解決這一問(wèn)題。研究以pColdTMTF為載體，在大腸桿菌中原核表達(dá)F1C菌毛主要亞單位FocA，驗(yàn)證表達(dá)的蛋白是否為可溶性蛋白，并對(duì)focA基因表達(dá)的最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體 工程菌Ecoli DH5α、BL21（DE3）均由湖南省微生物研究院保存?？寺≥d體pMD18-T Simple 載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。表達(dá)載體pET-22b（+）vector、pColdTMTF載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 TIANgel Midi Purification Kit（北京天根生物有限公司）；Expand High FidelityPLUS PCRSystem、dNTP（Roche公司）；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、溶菌酶、DL2 000、λHindⅢ DNA Marker（Takara公司）；標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白（Fermentas公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）、二巰基蘇糖醇（DTT）、丙烯酰胺（Sigma公司）；氨芐青霉素、IPTG、Triton X-100、N-四甲基乙二胺（TEMED）（上海生物工程公司）。其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 P×2 Thermal Cycler PCR儀（Thermo fisher scientific），臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf），臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Beckman公司），SDS-PAGE電泳儀及轉(zhuǎn)印裝置（Bio-Red），分光光度計(jì)（Eppendorf）、數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)JD-801（捷達(dá)公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照已發(fā)表的E.coli的F1C菌毛主要亞單位基因focA基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物，引入NdeI酶切位點(diǎn)，下游引物引入BamH I酶切位點(diǎn)。

Up-FocA：3'-CGCCATATGAAGTTAAAATTCAT CTCCATGGCTGTA-5'

Lo-FocA：3'-CAGGGATCCCTGGTACTGAACTT TAAAGGTG-5'

1.2.2 focA基因的擴(kuò)增 （1）制備PCR模板DNA。用煮沸裂解法制備PCR模板。取1 mL 37℃過(guò)夜振搖細(xì)菌培養(yǎng)物離心，沉淀用滅菌超純水洗一次，離心去上清，用200 μL滅菌超純水懸浮沉淀，煮沸10 min，10 000 r/min離心2 min，取上清作為PCR模板。（2） PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL；上下游引物各0.5 μL；Expand High Fidelity Enzyme（3.5 U/μL）0.5 μL；10×PCR buffer（with Mg2+）2.5 μL；滅菌去離子水17.5 μL。（3）PCR反應(yīng)程序。94℃ 4 min；94℃ 50 s；53℃ 50 s；72℃ 50 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴乙淀染色后，紫外燈下觀察并拍照。

1.2.3 pColdTMTF-focA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)（1）PCR產(chǎn)物的純化與重組質(zhì)粒pMD18-T-focA的構(gòu)建及重組質(zhì)粒酶切鑒定。用TIANgel Midi Purification Kit試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作。將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-Tsimple 用T4 DNA連接酶，16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，用氨芐青霉素抗性平板和限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析篩選鑒定陽(yáng)性克隆。從氨芐抗性LB平板上挑取假定陽(yáng)性菌落，用堿裂解法提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切，根據(jù)是否出現(xiàn)與預(yù)計(jì)大小相符的目的片段來(lái)確定目的基因是否已插入到pMD18-T vector。（2）重組質(zhì)粒pColdTMTF-focA的構(gòu)建及重組質(zhì)粒酶切鑒定。用NdeI和BamHI雙酶切消化focA-pMD18-T，用TIANgel Midi Purification Kit試劑盒回收FocA片段；載體pColdTMTF的NdeI和BamHI的雙酶切產(chǎn)物，經(jīng)苯酚/氯仿抽提純化后，與focA片段在4℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。用氨芐青霉素抗性LB平板和限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析篩選鑒定陽(yáng)性克隆。根據(jù)是否出現(xiàn)與預(yù)計(jì)大小相符的目的片段來(lái)確定目的基因是否已插入到pColdTMTF載體。（3）序列測(cè)定。取陽(yáng)性重組菌穿刺半固體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，寄上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 focA基因在pColdTMTF-focA載體中的原核表達(dá) focA基因在大腸桿菌中的原核表達(dá)參照文獻(xiàn)進(jìn)行［8］：將提取的重組質(zhì)粒focA-pColdTMTF轉(zhuǎn)化到BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物以1%的接種量于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.4～0.5時(shí)，15℃靜置30 min后，加入IPTG誘導(dǎo)，終濃度分別為0.1、0.4、0.7、1.0 mmoL/L，15℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。離心收集菌體，用滅菌超純水洗滌沉淀后，超聲波裂解，4℃12 000 r/min離心5 min，分別取上清和沉淀制樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，比較不同濃度IPTG誘導(dǎo)對(duì)focA基因表達(dá)的影響，SDS-PAGE參照文獻(xiàn)進(jìn)行［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖1所示。利用設(shè)計(jì)的引物以菌株E.coli1613基因組DNA為模板成功地?cái)U(kuò)增出了特異性目的條帶，其大小與預(yù)計(jì)的540 bp相一致。

圖1　F1C菌毛focA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

focA-pMD18-T重組質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約2.7 kb和540 bp兩個(gè)條帶，初步證明此質(zhì)粒為含有目的基因的重組質(zhì)粒（圖2）；pColdTMTF-FocA用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切的產(chǎn)物分別約為5.7 kb和540 bp（圖3）

2.3 序列測(cè)定結(jié)果分析

測(cè)序結(jié)果顯示，試驗(yàn)所克隆的focA序列與已登錄NCBI的focA基因序列相一致，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了該試驗(yàn)重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。

圖2　重組質(zhì)粒focA-pMD18-T的酶切圖譜

圖3　重組質(zhì)粒pColdTMTF-focA的酶切圖譜

2.4 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物分析

用重組質(zhì)粒pColdTMTF-focA轉(zhuǎn)化E.coli BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得pCold-focA-BL21（DE3）重組菌；分別用0.1、0.4、0.7、1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組菌，發(fā)現(xiàn)不同濃度IPTG誘導(dǎo)，重組菌的蛋白表達(dá)量差別不大（圖4）。

圖4　SDS-PAGE電泳分析

IPTG誘導(dǎo)后取菌體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌菌體裂解物比未經(jīng)誘導(dǎo)的明顯多出一條分子量約為66 kD的特異條帶（標(biāo)簽TF為48 kD，見(jiàn)圖4）。超聲波裂解菌體，發(fā)現(xiàn)蛋白存在于上清當(dāng)中，即FocA蛋白在pColdTMTF-focA重組質(zhì)粒中表達(dá)后以可溶性融合蛋白的形式存在（見(jiàn)圖5）。

圖5　SDS-PAGE電泳分析

3 討 論

外源基因在大腸桿菌中原核表達(dá)，表達(dá)的蛋白往往以不溶的無(wú)活性包涵體形式存在。包涵體形成的原因很多，一般是由于蛋白合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行正確的折疊，或二硫鍵不能正確的配對(duì)，從而導(dǎo)致蛋白的非特異性結(jié)合，目的蛋白卻無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等［10］。與可溶性蛋白相比，包涵體具雖然有不易破碎、抗酸堿、抗酶解、產(chǎn)量較大等特點(diǎn)［11］，但重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，將喪失了其生物活性。因此，必須對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，才能得到具有正確空間構(gòu)象的蛋白，而體外復(fù)性蛋白質(zhì)的效率較低，且復(fù)性后蛋白的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及天然蛋白。

為探尋focA基因表達(dá)的最佳條件，試驗(yàn)使用pCold表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FocA蛋白，通過(guò)對(duì)不同IPTG濃度誘導(dǎo)條件下重組菌蛋白表達(dá)進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的基因在pCold表達(dá)系統(tǒng)中于15℃下誘導(dǎo)24 h蛋白表達(dá)量最高，IPTG濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)都能表達(dá)目的基因，其中IPTG誘導(dǎo)濃度在0.1、0.4、0.7 和1.0 mmol/L時(shí)，目的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異。超聲波裂解誘導(dǎo)后的重組菌菌液，目的蛋白存在于上清中，說(shuō)明該重組蛋白是以可溶性形式存在。之前利用pET表達(dá)系統(tǒng)在37℃條件下加IPTG誘導(dǎo)，不表達(dá)FocA蛋白；而focA-pET22b（+）重組質(zhì)粒經(jīng)30℃在0.1～1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)范圍內(nèi)都能表達(dá)目的基因，但目的蛋白是以包涵體形式存在。

要使外源性蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，可以從宿主與載體的選擇、不同的培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)方法等方面來(lái)進(jìn)行探索。pCold表達(dá)載體采用了CspA啟動(dòng)子，誘導(dǎo)溫度在15～37℃之間，其中以15℃誘導(dǎo)效果最佳；在低溫誘導(dǎo)條件下，其他細(xì)胞蛋白的表達(dá)受到抑制，細(xì)菌生長(zhǎng)變得緩慢。這使得目的蛋白的表達(dá)量和純度得到增加，可以達(dá)到細(xì)胞蛋白的 60%。與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，其可溶性目的蛋白的表達(dá)量也大大增加。通過(guò)基因工程改造，目的蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，使得蛋白純化將不再需要對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性等操作，大大簡(jiǎn)化了表達(dá)程序和試驗(yàn)步驟，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，為目的蛋白的高效利用打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Prokaryotic Expression of Soluble FocA Protein with pColdTMTF Vector

ZENG Fa-jiao，SHU Yan， MIAO Dong，HU Xin-xu，ZENG Yan
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to express and purify F1C fimbriae mainly subunit FocA protein from uropathogenic Escherichia coli， this experiment expressed FocA protein in Escherichia coli BL21 （DE3） with pColdTMTF vector， verifiedits solublility， and optimized focA gene expression condition. The results showed that focA protein expression reached the highest in pCold expression system by IPTG induced for 24 h under 15℃， and there were no significant difference in expression under 0.1-1.0 mmol/L IPTG conditions. Moreover it was found that the target protein FocA-TF was soluble.

Escherichia coli； F1C fimbriae； FocA； prokaryotic expression

Q786

A

1006-060X（2016）07-0012-03

2016-04-22

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（14JJ4070）

曾發(fā)姣（1980-），女，湖南茶陵縣人，經(jīng)濟(jì)師，主要從事動(dòng)物健康養(yǎng)殖、動(dòng)物微生態(tài)制劑研究。

曾 艷