凌婉婷,徐冉芳,劉 娟,孫敏霞,李舜堯,朱雪竹,高彥征

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己烯雌酚降解菌固定化條件優(yōu)化及其降解性能

凌婉婷,徐冉芳,劉 娟,孫敏霞,李舜堯,朱雪竹,高彥征*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所,江蘇 南京 210095)

以海藻酸鈉為包埋劑,制備了己烯雌酚(DES)降解菌株S(sp.)的固定化菌劑,通過(guò)正交試驗(yàn)確定了菌株S的最佳固定化條件:海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,菌懸液與海藻酸鈉重量比為1:2,CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,交聯(lián)時(shí)間為6h.菌株S的固定化菌劑比游離菌株更有優(yōu)勢(shì);7d時(shí),固定化菌株S對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中DES的去除率為83.84%,較游離菌株高22.84%.優(yōu)化了固定化菌株S對(duì)溶液中DES的處理?xiàng)l件:固定化菌株S接入量為300g/L,初始底物濃度為20~40mg/L.固定化菌株S對(duì)DES濃度為40.01,37.90 ,33.52μg/L 3個(gè)排污口污水中DES的去除率分別達(dá)90.0%,96.0%,96.7%.利用固定化菌株處理實(shí)際污水中DES等雌激素具有應(yīng)用潛力.

雌激素；己烯雌酚；固定化；降解；污水

世界各國(guó)很多水體中均發(fā)現(xiàn)不同程度的雌激素污染,這對(duì)人群健康和生態(tài)安全產(chǎn)生不良影響[1-2].我國(guó)長(zhǎng)江,黃河流域水體中也有雌激素檢出.據(jù)報(bào)道,當(dāng)水體中雌激素濃度為1ng/L時(shí)就會(huì)對(duì)魚(yú)類的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾,造成雄魚(yú)雌性化現(xiàn)象[3-5].如何去除水體中雌激素已成為當(dāng)前環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一.

雌激素性質(zhì)穩(wěn)定,單純自然衰減無(wú)法消除雌激素污染,其殘存效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)很大.利用功能微生物來(lái)高效降解雌激素受到關(guān)注.研究者從污泥,土壤等介質(zhì)中分離獲得了多株雌激素降解菌[6-8].楊俊等[6]從制藥污泥中分離了1株高效降解17β-雌二醇(E2)的菌株sp.,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,7d內(nèi)該菌株可將初始濃度為0.5~50mg/L的17β-E2完全降解.Yoshimoto等[7]從污水處理廠活性污泥中分離了1株和3株,其中對(duì)雌激素具有強(qiáng)降解能力,24h內(nèi)可將濃度為100mg/L的雌酮(E1),E2,雌三醇(E3)完全降解.從環(huán)境中篩選出具有雌激素降解性能的菌株,有望實(shí)現(xiàn)雌激素的高效降解.然而目前對(duì)于己烯雌酚(DES)降解菌的發(fā)現(xiàn)仍很少.

由于實(shí)際污水成分復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)室篩選的功能菌株往往因不適應(yīng)環(huán)境造成活性抑制,與土著微生物競(jìng)爭(zhēng)處于劣勢(shì),且存在難以回用等問(wèn)題,其應(yīng)用受到限制[9].固定化微生物技術(shù)因具有生物密度大,耐環(huán)境沖擊,可回收利用,反應(yīng)過(guò)程易于控制,處理效率高等優(yōu)點(diǎn),彌補(bǔ)了游離菌株的不足,目前已被應(yīng)用于一些有機(jī)污染物的處理[10-11].微生物固定化技術(shù)是在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù).海藻酸鈉常被用作微生物固定化的包埋劑[12-13].須指出,迄今仍少有利用固定化菌劑來(lái)處理水中DES等雌激素的相關(guān)報(bào)道.

本研究在前期分離得到1株能夠以DES為唯一碳源和能源的菌株S(sp.),在此基礎(chǔ)上以海藻酸鈉為包埋劑,采用正交試驗(yàn)法,以固定化菌株對(duì)DES的去除效率為主要指標(biāo),確定了菌株固定化條件;分析了固定化菌株S對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和實(shí)際污水中DES的去除性能.研究結(jié)果可為發(fā)展雌激素降解菌的固定化技術(shù),治理雌激素污染等提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用DES降解菌株S分離自南京某污水處理站的活性污泥,經(jīng)鑒定為沙雷氏菌屬(sp.)細(xì)菌[10].包埋劑選用海藻酸鈉,為化學(xué)純;交聯(lián)劑選用CaCl2,為分析純.DES購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司,純度>98%.C18為分析純.

LB培養(yǎng)基,無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MS),DES降解培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[8].固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂.

1.2 菌株S固定化菌劑的制備

以海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A),菌懸液與海藻酸鈉的重量比(B),CaCl2濃度(C)及交聯(lián)時(shí)間(D)為試驗(yàn)因素,采用正交試驗(yàn)法[12],設(shè)計(jì)4因子3水平的正交表(表1),以DES去除率為衡量指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)各固定化處理優(yōu)劣.圖1為固定化微生物小球制備流程.制備固定化菌劑的方法:菌株S分別接種于LB培養(yǎng)基,搖床30℃,150r/min振蕩24h后,調(diào)600=1.0;將含菌株S的菌懸液按一定體積比混勻后,與海藻酸鈉以一定的菌膠比充分混勻,勻速滴入4℃的CaCl2溶液后,于4℃交聯(lián)一定時(shí)間,得到直徑為3~5mm的固定化顆粒.用無(wú)菌生理鹽水沖洗后使用.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 菌株S固定化菌劑對(duì)溶液中DES的去除

在DES濃度分別為20,40,60,80,100mg/L的無(wú)機(jī)鹽降解培養(yǎng)基中,按100,200,300,400,500g/L的接入量分別加入上述制備的各固定化降解菌劑,30℃,150r/min搖床培養(yǎng)0~7d后測(cè)定溶液中DES濃度,計(jì)算DES去除率.以接入相等菌量的游離菌劑的處理作為陽(yáng)性對(duì)照,不接種微生物的空白小球的處理作為陰性對(duì)照.每個(gè)處理重復(fù)3 次.溶液中DES濃度測(cè)定采用整瓶提取培養(yǎng)基的方法[8].

1.4 菌株S固定化菌劑對(duì)污水中DES的去除

實(shí)際污水樣品采自南京市區(qū)內(nèi)某湖泊的三個(gè)污水排水口.將采集的水樣1L經(jīng)固相萃取柱富集濃縮(富集倍數(shù)500),經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn),3個(gè)生活污水排水口處的湖水中均檢測(cè)到DES,濃度分別為40.01,37.90,33.52μg/L.

按海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,菌懸液與海藻酸鈉之比1:2,CaCl2濃度4%,交聯(lián)時(shí)間6h的固定化條件制備固定化降解菌株S菌劑.按300g/L的菌劑接種量,在1L污水樣中投入固定化降解菌株S菌劑,30℃,150r/min搖床振蕩培養(yǎng)7d后,測(cè)定水樣中DES含量,計(jì)算去除率.每個(gè)處理重復(fù)3次.

處理后的水樣以約為5~8mL/L的流速通過(guò)已分別用5.00mL甲醇和5.00mL超純水活化的裝填有C18的固相萃取柱萃取,用5.00mL超純水淋洗柱體并繼續(xù)抽吸3.0min,淋洗后的萃取柱用15.00mL甲醇洗脫,洗脫液收集至玻璃試管中.試管置于40℃的恒溫水浴并用氮?dú)獯蹈?然后加入50%甲醇水溶液將附著物重新溶解至2.00mL,過(guò)0.22μm孔徑濾膜后HPLC分析[8,14].

2 結(jié)果分析與討論

2.1 菌株S最佳固定化條件

按照前述正交試驗(yàn),制備了9種菌株S的固定化菌劑,研究了其對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中DES的去除性能,以去除率為指標(biāo)評(píng)價(jià)了菌株S最佳固定條件.從圖2可見(jiàn),4個(gè)因子均顯著影響溶液中DES的去除.利用正交試驗(yàn)的直觀分析法,對(duì)其結(jié)果進(jìn)行解析,得出4個(gè)因子對(duì)DES去除的影響大小順序是:海藻酸鈉濃度>菌懸液與海藻酸鈉重量比>CaCl2濃度>交聯(lián)時(shí)間.根據(jù)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中DES的去除率,選用菌株S的最佳固定化條件為:海藻酸鈉濃度4%,菌懸液與海藻酸鈉之比為1:2,CaCl2濃度為4%,交聯(lián)時(shí)間為6h.該條件下制備的固定化菌劑形貌如圖3所示.固定化菌株S呈球形,直徑約為3~5mm.實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉濃度為3~4%時(shí),易成球;若海藻酸鈉濃度為5%時(shí),則易發(fā)生拖尾現(xiàn)象,成球較困難;段海明等[15]用海藻酸鈉固定化細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象.

2.2 菌株S固定化菌劑對(duì)溶液中DES的去除

2.2.1 固定化菌與游離菌去除DES的比較 以DES為唯一碳源,研究了菌株S的固定化菌劑和游離菌株對(duì)溶液中DES的去除作用,溶液中DES的起始濃度為50mg/L,游離菌株接入量與固定化菌劑中菌株接入量相同.由圖4可見(jiàn),供試時(shí)間內(nèi)(0~7d),固定化菌劑對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中DES的去除率均顯著地高于游離態(tài)菌株S.1d時(shí),游離態(tài)菌劑對(duì)溶液中DES沒(méi)有去除作用,這是因?yàn)殚_(kāi)始階段(0~1d)DES對(duì)游離態(tài)菌株的生長(zhǎng)和活性產(chǎn)生一定抑制.1d時(shí),固定化菌劑則去除了溶液中9.18%的DES,且與無(wú)菌株空白小球的去除率無(wú)顯著差異,這表明,0~1d時(shí)固定化菌劑對(duì)溶液中DES去除主要依賴于海藻酸鈣凝膠小球?qū)θ芤褐蠨ES的吸附作用.隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)(1~7d),固定化菌劑和游離菌株處理的溶液中DES殘留濃度均降低,去除率則不斷升高;經(jīng)7d處理后,固定化菌劑和游離態(tài)菌劑對(duì)溶液中DES的去除率分別達(dá)83.84%和68.25%,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于無(wú)菌株空白小球的去除率.1~7d,無(wú)菌株空白小球?qū)θ芤褐蠨ES的去除率基本恒定,表明海藻酸鈣凝膠小球?qū)ES的吸附在1d時(shí)已達(dá)到飽和.

從去除機(jī)制來(lái)看,菌株S固定化菌劑對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中DES的去除主要包含兩種作用,一是固定化小球(海藻酸鈣)自身吸附DES,這可以從無(wú)菌空白小球?qū)ES的去除得到證明,二是固定化小球中菌株S降解DES[9,16].0~1d時(shí),固定化菌劑和無(wú)菌空白小球的處理能力一致,表明此時(shí)固定化菌劑對(duì)溶液中DES的去除主要?dú)w因海藻酸鈣的吸附作用;1~7d,固定化菌劑去除溶液中DES性能不斷提高,且與無(wú)菌空白小球的去除率間差距增大,而無(wú)菌空白小球的去除率則在1~7d保持不變,說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)(1~7d),固定化菌劑對(duì)溶液中DES的去除從海藻酸鈣吸附為主演變?yōu)楣潭ɑ闟的降解為主;7d時(shí),無(wú)菌空白小球處理的去除率僅為15.58%,而固定化菌劑處理的去除率則為83.84%,吸附機(jī)制所占貢獻(xiàn)為15.58%,而菌株S降解則貢獻(xiàn)了68.26%.

菌株S固定化菌劑比游離菌株有更好的處理效果,這一方面是因?yàn)樾纬晒潭ɑ鷦┑暮Ｔ逅徕}凝膠小球內(nèi)部呈多孔道結(jié)構(gòu),對(duì)DES具有吸附作用,另一方面,固定化載體對(duì)菌株起到了保護(hù)作用,同時(shí)增加了菌體與DES的接觸機(jī)會(huì).DES在由固定化載體表面擴(kuò)散至載體內(nèi)部過(guò)程中,生長(zhǎng)在載體孔道表層的菌落形成了一層保護(hù)屏障,增強(qiáng)了菌株抵抗能力,從而使得菌株能更好地生長(zhǎng)和增殖[9,13],而游離菌株S在溶液中易受到DES毒害,生長(zhǎng)受到抑制[17-18],故其降解DES的效率較低.

2.2.2 固定化菌劑接入量的影響 研究了固定化菌劑接入量對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中DES去除的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5.隨著固定化降解菌接入量由0增大至300g/L,溶液中DES去除率顯著增大;菌劑接入量為300g/L時(shí),固定化降解菌對(duì)溶液中DES的降解率達(dá)85.2%.但當(dāng)菌劑接入量繼續(xù)增大(由300g/L增大至500g/L),溶液中DES去除率無(wú)顯著提高.因此,固定化降解菌籍最適接入量為300g/L,該接入量既能保證溶液中DES較好的去除效果,也減少了固定化降解菌的使用量,從而可降低實(shí)際應(yīng)用的原料成本.試驗(yàn)過(guò)程中,當(dāng)固定化降解菌接入量較大時(shí),降解體系較混濁,這可能是因?yàn)楣潭ɑ到饩訢ES為碳源和能源物質(zhì),接入量較大時(shí),細(xì)胞因缺乏足夠營(yíng)養(yǎng)而活性較低,出現(xiàn)了菌體自溶死亡現(xiàn)象,死亡的細(xì)胞物質(zhì)滲出造成培養(yǎng)基濁度增加[15].

2.2.3 DES初始濃度的影響 圖6為DES初始底物濃度對(duì)固定化降解菌去除溶液中DES性能的影響.當(dāng)DES濃度較低時(shí)(20mg/L和40mg/L),固定化降解菌對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中DES的去除率較高,分別為86.8%和86.2%.隨著底物濃度升高(20到100mg/L),固定化降解菌對(duì)DES的去除率下降.表明高濃度DES對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,進(jìn)而使得DES去除率減小.在實(shí)際使用中,應(yīng)適時(shí)檢測(cè)環(huán)境中DES的實(shí)際污染濃度,據(jù)此來(lái)進(jìn)一步科學(xué)地確定固定化降解菌劑的使用量,進(jìn)而節(jié)約成本并提高處理效能.

2.3 菌株S固定化菌劑對(duì)實(shí)際污水中DES的去除

固定化菌株S對(duì)實(shí)際污水中DES去除見(jiàn)圖7,3個(gè)污水排水口處湖水中DES濃度分別為40.01,37.90,33.52μg/L.經(jīng)固定化菌劑處理后,排水口1,排水口2,排水口3水樣中DES去除率分別為90.0%,96.0%,96.7%.固定化降解菌株對(duì)實(shí)際污水中DES有較好的去除效果(去除率90.0%以上),可能是因?yàn)閷?shí)際污水中DES濃度較低,且固定化載體對(duì)菌株具有一定的保護(hù)效果,菌株受到外界環(huán)境的毒害作用很小,故而表現(xiàn)出較好的降解效果.

本研究中固定化菌劑包菌量偏低,海藻酸鈣吸附能力也不強(qiáng),導(dǎo)致了處理無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液和污水中DES時(shí)菌劑投加量偏多,該問(wèn)題仍需要進(jìn)一步針對(duì)性地完善.研究結(jié)果表明,構(gòu)建雌激素固定化菌劑,可高效地去除水中DES.固定化后菌株具有相對(duì)封閉和穩(wěn)定的空間,能保證細(xì)菌正常代謝,屏蔽外界土著微生物惡性競(jìng)爭(zhēng),防止噬菌體吞噬等[8].固定化菌劑在治理污水中DES等雌激素方面有一定可行性和優(yōu)越性,可為無(wú)害化處理污水中雌激素提供新思路和基礎(chǔ)依據(jù).

3 結(jié)論

3.1 以海藻酸鈉為包埋劑,制備了菌株S的固定化菌劑,通過(guò)正交試驗(yàn)確定了菌株S最佳固定化條件:海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,菌懸液與海藻酸鈉重量比為1:2,CaCl2濃度為4%,交聯(lián)時(shí)間為6h.

3.2 菌株S的固定化菌劑比游離菌株更有優(yōu)勢(shì).7d時(shí),固定化菌株S對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中DES的去除率為83.84%,較游離菌株高22.84%.優(yōu)化了菌株S的固定化菌劑對(duì)溶液中DES的處理?xiàng)l件:固定化菌劑接入量300g/L,初始底物濃度20~ 40mg/L.

3.3 菌株S的固定化菌劑對(duì)DES濃度為40.01, 37.90 ,33.52μg/L 3個(gè)排污口污水中DES去除率分別達(dá)90.0%,96.0%,96.7%;利用固定化菌株處理污水中雌激素具有應(yīng)用潛力.

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* 責(zé)任作者, 教授, gaoyanzheng@njau.edu.cn

Immobilization and degradation performance of diethylstilbestrol-degrading bacteria S (sp.)

LING Wan-ting, XU Ran-fang, LIU Juan, SUN Min-xia, LI Shun-yao, ZHU Xue-zhu, GAO Yan-zheng*

(Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation, College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)., 2016,36(5)：1514~1519

Diethylstilbestrol (DES)-degrading bacteria S (sp.) was immobilized using sodium alginate as the embedding agent. The optimum immobilization conditions, determined through orthogonal test, were as follows: 4% sodium alginate, bacteria: sodium alginate 1:2, 4% CaCl2and 6h crosslinking time. The DES degradation performance of immobilized strain S was apparently superior to that of free strain. The degradation ratio of DES by immobilized strain S was 83.84%, which was 22.84% higher than that by free strain S under laboratory culture conditions. The optimum inoculation of immobilized strain S was 300g/L, and the optimum initial DES concentration was 20~40mg/L. Three water samples were collected from sewage outfalls with DES concentrations of 40.01, 37.90 and 33.52μg/L, respectively. Immobilized strain S was added to these water samples, and 90.0%, 96.0% and 96.7% of DES were removed by immobilized strain S after 7d. Results of this investigation provide a new available technique for estrogen removal from polluted water systems.

estrogen；diethylstilbestrol；immobilization；degradation；sewage

X703.5

A

1000-6923(2016)05-1514-06

凌婉婷(1976-),女,貴州遵義人,教授,博士,主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)環(huán)境污染控制.發(fā)表論文80余篇.

2015-11-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(51278252,21477056);江蘇省環(huán)?？蒲姓n題(2015023);江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(BE2015682)