楊鳳華

(江蘇省口岸中學(xué) 225321)

人教版高中生物學(xué)教材選修1中介紹了用平板劃線法純化大腸桿菌。以下是對(duì)該實(shí)驗(yàn)在教學(xué)過程中遇到的幾個(gè)問題的思考。

1 為什么在操作的每一步前后都要灼燒接種環(huán)

操作開始時(shí)灼燒接種環(huán)，是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線之前灼燒接種環(huán)，是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)接種環(huán)上的菌種直接來自上次劃線的末端，通過劃線次數(shù)的增加而使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落；劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，防止污染環(huán)境和感染操作者。

2 如何讓初學(xué)者在劃線無痕的平板上確定5個(gè)區(qū)域

由于平板冷卻凝固之后，是倒過來放置的，正好使得皿蓋在下皿底在上。可以在皿底的背面用記號(hào)筆將平板分成面積不等的5個(gè)小區(qū)域(圖1)，第1區(qū)面積最小，作為待分離菌的菌源區(qū)；第2、3、4區(qū)是逐級(jí)稀釋的過渡區(qū)；第5區(qū)則是關(guān)鍵區(qū)，通過劃線操作使該區(qū)出現(xiàn)大量的單菌落以供挑選純種用。平板上5個(gè)區(qū)面積的分配應(yīng)是5>4>3>2>1。待到劃線接種時(shí)，操作者就可以將接種環(huán)沿著記號(hào)的順序和位置進(jìn)行劃線，這樣既能保證第2、3、4、5次劃線都是從上一區(qū)域的末端開始，而且第5區(qū)域和第1區(qū)域不相連，又能便于充分利用整個(gè)平板的面積，得到較多的典型單菌落。

圖1 平板劃線的5個(gè)區(qū)域

3 為什么要將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

①倒置培養(yǎng)能很大程度減少外來微生物的侵染；②培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的水蒸氣不會(huì)停留在皿蓋上而影響觀察，因?yàn)槿襞囵B(yǎng)皿正放進(jìn)行溫育(例如，37℃或是更高的溫度)，培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)遇皿蓋冷凝后會(huì)滴回培養(yǎng)基表面，進(jìn)而影響菌落的分布；③培養(yǎng)皿倒置后，在重力的作用下，菌落生長(zhǎng)比較集中，不會(huì)蔓延得太快，更容易得到單菌落；④在用強(qiáng)制通風(fēng)的培養(yǎng)箱里，倒置平板可以減少培養(yǎng)基表面的空氣流動(dòng)，使培養(yǎng)基水分蒸發(fā)減慢，水分不易流失，防止培養(yǎng)基斷裂。

4 如何界定平板劃線技術(shù)是否合格

培養(yǎng)24h后觀察平板，①平板應(yīng)無雜菌污染；②劃線應(yīng)為直的，且每一線都接近平板邊緣，平行的線和線之間要緊密，但不能搭在一起；③要有較多的單菌落，至少應(yīng)有10個(gè)以上的單菌落方為合格。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)示意圖

1.2 細(xì)菌的獲得性免疫 當(dāng)外源DNA侵入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，CRISPR/Cas復(fù)合體識(shí)別入侵DNA中的原間隔序列附近的毗鄰基序(PAM)，將外源DNA片段的原間隔序列剪切成間隔序列，并整合進(jìn)兩個(gè)重復(fù)序列之間，形成記憶[2]。

當(dāng)細(xì)菌第二次受到相同外源DNA入侵時(shí)，CRISPR 基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體 CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在 Cas9蛋白和核酸內(nèi)切酶Ⅲ的作用下被剪切成一些小的RNA 單元，這些小RNA即為成熟的crRNA，它由一個(gè)間隔序列和其兩側(cè)的重復(fù)序列組成。然后crRNA和tracrRNA結(jié)合，形成tracrRNA∶crRNA復(fù)合分子，并在Cas9蛋白的協(xié)助下，使原間隔序列與crRNA序列配對(duì)，由此識(shí)別出外源DNA的PAM序列。同時(shí)，Cas9蛋白發(fā)揮核酸酶的功能，將入侵的外源DNA分子剪切掉。而細(xì)菌自身的間隔序列，由于沒有PAM序列，因而不會(huì)被剪切掉[3]。由此可見，原核生物的這種防衛(wèi)外源DNA的方式，類似于人體內(nèi)的獲得性免疫：CRISPR/Cas系統(tǒng)賦予了原核生物對(duì)外源DNA的記憶性和特異性。

外來的間隔序列是高度可變的，不同的間隔序列代表入侵的不同外源DNA，可以是病毒的，也可以是質(zhì)?；蚱渌庠碊NA分子。

2 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用

從上述CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用原理可以看出，CRISPR/Cas 系統(tǒng)與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對(duì)序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與 Cas 蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別靶序列上的PAM以及原間隔序列。根據(jù)這一特性，科學(xué)家將其設(shè)計(jì)成人工的限制酶，用以對(duì)感興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割修飾。目前發(fā)現(xiàn)的3類CRISPR/Cas系統(tǒng)中，Ⅱ型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對(duì)簡(jiǎn)單，除 crRNA 和 tracrRNA 外，只有一個(gè)Cas9蛋白。

要實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)真核生物基因組的定點(diǎn)修飾，只需要滿足兩個(gè)條件：一個(gè)Cas9蛋白，一條向?qū)NA(gRNA)。向?qū)NA由兩部分組成：一段約20個(gè)堿基的RNA片段(相當(dāng)于crRNA)，此片段可以和定點(diǎn)修飾的靶標(biāo)基因配對(duì)；另一段為60個(gè)堿基的RNA片段(相當(dāng)于tracrRNA)，此片段對(duì)激活Cas9蛋白是必需的。針對(duì)要修飾的靶標(biāo)基因(如某種致病基因)，設(shè)計(jì)好crRNA的序列，然后將Cas9基因和gRNA基因重組到質(zhì)粒中，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定靶標(biāo)基因的修飾改造[3]。

Cas9:gRNA核糖核蛋白復(fù)合體相當(dāng)于人工限制性核酸內(nèi)切酶，只不過其特異性切割的靶標(biāo)序列可以人為地設(shè)計(jì)。當(dāng)受體細(xì)胞的靶標(biāo)序列被切開后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，通過精確的同源重組修復(fù)機(jī)制或非同源重組的末端連接修復(fù)機(jī)制，就能實(shí)現(xiàn)外源正?；虻亩c(diǎn)插入，從而達(dá)到替換致病基因的目的[2]。

CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)誕生于2013年，與之前的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)(ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù))相比，CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)有準(zhǔn)確性高，脫靶率低的特點(diǎn)，而且技術(shù)要求簡(jiǎn)單，容易操作[3]，費(fèi)用也很低。這項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)，堪比基因測(cè)序技術(shù)、DNA重組技術(shù)、PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)，必定具有劃時(shí)代的意義。

目前，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)已經(jīng)在釀酒酵母、擬南芥、小鼠等多種模式生物中應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因組DNA的編輯。2014年年初，我國(guó)學(xué)者黃行許等人利用該技術(shù)對(duì)獼猴胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，獲得兩只嵌合的“基因編輯猴”。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)涉及的倫理問題

Cas9蛋白識(shí)別的PAM序列(5′-AGG-3′)在人類基因組中平均每8個(gè)堿基就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)。從理論上說，任何一個(gè)基因都可以通過CRISPR/Cas9進(jìn)行編輯改造，包括對(duì)人類生殖細(xì)胞的基因進(jìn)行編輯。例如，針對(duì)某些單基因遺傳病，用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)生殖細(xì)胞中的致病基因進(jìn)行編輯改造，以便一勞永逸地解決某些家族遺傳病。

2015年3月，我國(guó)中山大學(xué)的研究小組利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)人類胚胎中導(dǎo)致β型地中海貧血癥的基因進(jìn)行修飾。他們針對(duì)致病基因設(shè)計(jì)和生成了3個(gè)gRNA，并將其與CRISPR/Cas9基因一起重組進(jìn)表達(dá)載體中，然后注入收集到的86個(gè)三原核胚胎(此為人工授精過程中出現(xiàn)異常的不能夠正常發(fā)育的三倍體胚胎)，結(jié)果獲得71個(gè)存活胚胎，并對(duì)其中的54個(gè)進(jìn)行遺傳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示：有28個(gè)獲得了成功的剪切[4]。這是人類首次對(duì)自身胚胎進(jìn)行基因編輯的嘗試。該研究論文被《Nature》和《Science》退稿，但最終在線發(fā)表于國(guó)內(nèi)英文學(xué)術(shù)期刊《Protein & Cell》上。令人意想不到的是，這篇論文發(fā)表后在學(xué)術(shù)界引發(fā)了巨大的倫理爭(zhēng)議。國(guó)內(nèi)許多生物學(xué)家對(duì)此給予極力的肯定，但遭到國(guó)外多數(shù)同行的強(qiáng)烈指責(zé)。全世界近20個(gè)國(guó)家立法禁止改造生殖細(xì)胞的基因，而我國(guó)還沒有相關(guān)的法律限制；國(guó)內(nèi)的許多學(xué)者認(rèn)為，我們要乘西方國(guó)家在這方面的倫理限制，抓住機(jī)遇，搶占人類基因編輯研究的制高點(diǎn)；哈佛大學(xué)干細(xì)胞研究專家George Daley也贊同此項(xiàng)研究：“這是CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于人體胚胎細(xì)胞基因修飾的一個(gè)里程碑式的研究，它向人們顯示了未來在根除致病基因方面具備的潛力” 。但美國(guó)再生醫(yī)學(xué)聯(lián)盟主席Edward Lanphier和CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)明者之一的Jennifer Doudna等不少學(xué)者都表示，應(yīng)禁止該技術(shù)應(yīng)用于人類生殖細(xì)胞基因的改造；美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院院長(zhǎng)也聲明這是“不可逾越的紅線”。2015年5月18日，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院和美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)院宣布，將發(fā)起一項(xiàng)重要的倡議，為編輯人類基因組制定指導(dǎo)性規(guī)范。

人類生殖細(xì)胞的基因編輯技術(shù)目前還處于初級(jí)階段，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)比起以前的兩項(xiàng)基因定點(diǎn)編輯技術(shù)(ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù))來說，編輯的準(zhǔn)確率已經(jīng)有了很大的提高，但還不能達(dá)到100%。要實(shí)現(xiàn)人類生殖細(xì)胞的編輯，一定要達(dá)到100%的準(zhǔn)確率。但是，即使達(dá)到了100%的準(zhǔn)確率，就可以肆無忌憚地對(duì)人類基因進(jìn)行編輯嗎？改造人類生殖細(xì)胞的基因必然涉及以下幾個(gè)問題：①被改造的基因和其他基因的關(guān)系搞清楚了嗎？改造某個(gè)基因，產(chǎn)生的影響有多大？②這種改造是不可逆的，而且會(huì)隨著生殖而遺傳，一旦出現(xiàn)了不合適的改造，如何來糾錯(cuò)？③致病基因可以被改造，那么其他諸如高矮、胖瘦、聰明等基因呢？能否被改造？④改造必然影響人類基因的多樣性，這會(huì)影響人類的進(jìn)化嗎？ 隨著基因編輯技術(shù)的日趨成熟，這些問題值得人們深思。