劉清忠 王大斌 韓麗梅 曹覓 齊旭升（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000）

·研究報(bào)告·

側(cè)腦室注射丹參酮對(duì)腦癱模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響*

劉清忠 王大斌 韓麗梅 曹覓 齊旭升△
（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000）

目的觀察側(cè)腦室注射丹參酮對(duì)腦癱模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響，探討其可能機(jī)制。方法Wistar大鼠30只，分為模型組和丹參酮組，采用手術(shù)切除大腦皮質(zhì)和部分大腦組織的方法建立腦癱模型。丹參酮尾靜脈給藥治療15 d。用水迷宮儀進(jìn)行定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)，并用懸吊試驗(yàn)和斜坡試驗(yàn)比較大鼠行神經(jīng)行為學(xué)改變，測(cè)定治療前后外周血丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。結(jié)果丹參酮組大鼠水迷宮中找平臺(tái)次數(shù)減少，找到平臺(tái)時(shí)間和懸吊試驗(yàn)掉頭轉(zhuǎn)向上時(shí)間顯著縮短，大鼠在第1象限和中環(huán)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，定位航行中潛伏期和游泳距離降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。外周血MDA和NO明顯降低，SOD明顯增高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮能促進(jìn)腦癱大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制有可能為丹參酮擴(kuò)張大腦微動(dòng)脈，增加腦組織血流量，并通過(guò)增強(qiáng)SOD的活性來(lái)降低MDA和NO對(duì)腦組織神經(jīng)細(xì)胞的損害，達(dá)到改善大鼠缺血缺氧狀態(tài)從而促進(jìn)神經(jīng)組織功能的恢復(fù)。

丹參酮腦癱動(dòng)物模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)學(xué)習(xí)記憶能力

【Abstract】Objective：To establish a rat animal model of cerebral palsy，to observe the effect of intracerebroventricular injection of Tanshinone on neurological behavior and to explore the possible mechanism of treatment of cerebral palsy.M ethods：30Wistar ratswere divided into themodel group and tanshinone group，ratanimalmodel of cerebral palsy established by surgical resection of the cerebral cortex and brain tissue.Tanshinone intravenous injection was taken for 15 days，watermaze apparatus for positioning navigation and space exploration experiments，and suspension testand ramp test rat nerve behavioral changes.Before and after treatment，contentof peripheral blood MDA，NO and SOD wasmeasured.Results：Rats of tanshinone group in Morris watermaze reduce the number of finding a platform，and finding time and the time of turning up significantly shorten.Residence time in the first quadrant and the central reduced.Latency and swimming distance were decreased in positioning navigation.Compared withmodel group，the difference was statistically significant（P《0.05）.The peripheral blood MDA and NO decreased significantly；SOD increased significantly.Compared with model group，the differencewas statistically significant（P《0.05）.Conclusion：Tanshinone can promote learning and memory ability of cerebral palsy rats，whosemechanism may be related with tanshinone's expanding brain arteriole，increasing cerebral blood flow，and enhancing SOD activity to reduce damage of MDA and NO to the brain nerve cells，and improve ischemia hypoxia state of rats so as to promote the recovery of nerve function.

【Key words】Tanshinone；Animalmodel of cerebral palsy；Rat；Neuroethology；Learning and memory ability

腦性癱瘓（CP）是出生前到出生后數(shù)月內(nèi)腦發(fā)育階段因腦組織缺血缺氧等多種原因?qū)е碌哪X損傷、腦發(fā)育缺陷所致的智力及軀體運(yùn)動(dòng)障礙性綜合征［1］。CP是腦組織出現(xiàn)病理性改變，臨床以中樞性運(yùn)動(dòng)功能障礙為主，并伴有智力低下、語(yǔ)言障礙等臨床表現(xiàn)［2］。因CP的發(fā)生發(fā)展是因腦組織缺血缺氧等因素引起，而丹參酮的主要有效成分為丹參酮、丹參素和丹參酮甲酯等［3］具有抗組織缺氧、清除自由基、擴(kuò)張微循環(huán)和血管調(diào)節(jié)等功能［4］。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)用丹參酮側(cè)腦室注射，利用其擴(kuò)管作用直接作用于腦組織，來(lái)觀察其對(duì)CP大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，由十堰市太和醫(yī)院科技中心動(dòng)物房提供［許可證SYXK（鄂）2011-0031］，實(shí)驗(yàn)均在科技中心標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［SCXK（鄂）2011-0008］完成。動(dòng)物分組前先用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和丹參酮組各10只。

1.2試劑與儀器Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；ZS-B型大鼠立體定位儀（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；丹參酮（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)H31022558）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號(hào)302-17-0）。

1.3造模與給藥參照文獻(xiàn)［5］方法，模型組及丹參酮組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛30mg/kg麻醉。俯臥位固定于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，剪去頭頂部位鼠毛，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒后鋪無(wú)菌手術(shù)巾，行顱頂后正中切口（2 cm），逐層切開皮膚及皮下組織，用拉鉤向兩側(cè)拉開皮膚，刮去骨膜暴露矢狀縫，用牙科鉆鉆出直徑0.6 cm小孔形成顱骨窗，用眼科手術(shù)刀沿顱骨窗邊緣切開硬腦膜以暴露出大腦皮質(zhì)，再用眼科手術(shù)刀沿顱骨窗邊緣切開深約4mm的大腦皮質(zhì)，小心剝離出大腦皮質(zhì)及部分大腦髓質(zhì)，然后用醫(yī)用棉紗壓迫止血，生理鹽水沖洗創(chuàng)面，分層縫合皮下組織和皮膚，用碘伏消毒皮膚。對(duì)照組麻醉后行顱頂后正中切口，15 min后分層縫合皮下組織。造模后第1日，丹參酮按10mg/ （kg·d）的用量，從尾靜脈注射丹參酮注射液給藥，每日1次。對(duì)照組和模型組按1 mL/（kg·d）從尾靜脈注射生理鹽水，每日1次。3組均治療15 d。

1.4觀察指標(biāo)參照文獻(xiàn)［6］擬定，采用懸吊試驗(yàn)和斜坡試驗(yàn)觀察肢體肌力及軀體平衡功能的隨意運(yùn)動(dòng)。采用Morris水迷宮試驗(yàn)法觀察學(xué)習(xí)記憶能力［7］，空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)撤掉迷宮儀中平臺(tái)，觀察大鼠1、7、15 d在水迷宮中尋找平臺(tái)的運(yùn)行軌跡。于治療前和治療第15日從大鼠眶靜脈取250μL靜脈血，肝素抗凝，測(cè)試盒測(cè)定治療前后用丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1各組一般情況比較對(duì)照組運(yùn)動(dòng)靈活，舔毛自潔、攝食及飲水正常，無(wú)動(dòng)物死亡。模型組大鼠肢體活動(dòng)少、跛行、左前肢及左前爪屈曲痙攣、精神及自潔情況差，攝食及飲水量減少，2只死亡。丹參酮組大鼠治療后精神較模型組稍好，會(huì)舔毛自潔，肢體活動(dòng)、攝食及飲水逐步接近正常，無(wú)動(dòng)物死亡。

2.2各組大鼠隨意運(yùn)動(dòng)比較見表1。對(duì)照組運(yùn)動(dòng)靈活、穩(wěn)定性好，動(dòng)作敏捷、準(zhǔn)確，懸吊時(shí)間長(zhǎng)，斜坡試驗(yàn)反應(yīng)迅速，及時(shí)將頭轉(zhuǎn)向上方，用時(shí)較短。模型組運(yùn)動(dòng)靈活性降低，穩(wěn)定性差，右側(cè)肢體無(wú)力顫抖，懸吊試驗(yàn)很快掉落桌，斜坡試驗(yàn)反應(yīng)遲緩，不能及時(shí)將頭轉(zhuǎn)向上方，用時(shí)較長(zhǎng)，懸吊試驗(yàn)和斜坡試驗(yàn)用時(shí)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮組大鼠治療后懸吊試驗(yàn)時(shí)間縮短，斜坡試驗(yàn)時(shí)間縮短，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠隨意運(yùn)動(dòng)比較（±s）

表1　各組大鼠隨意運(yùn)動(dòng)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同。

組別n懸吊試驗(yàn)（min）斜坡試驗(yàn)（s）對(duì)照組10 4.19±0.37 3.49±0.25模型組8 1.01±0.13△5.43±0.34△丹參酮組10 2.87±0.21*4.02±0.27*

2.3各組大鼠空間探索試驗(yàn)比較見表2。模型組大鼠學(xué)習(xí)找平臺(tái)所需的次數(shù)和時(shí)間明顯增多，第1、2象限停留時(shí)間明顯降低，大鼠在中環(huán)停留長(zhǎng)于內(nèi)環(huán)和外環(huán)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮組大鼠治療后大鼠學(xué)習(xí)找平臺(tái)所需的次數(shù)明顯減少，大鼠在第1象限和中環(huán)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組大鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表2　各組大鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

組別n學(xué)習(xí)找平臺(tái)次數(shù)（n）內(nèi)環(huán)（s）中環(huán)（s）外環(huán)（s）第1象限（s）第2象限（s）第3象限（s）第4象限（s）對(duì)照組10 4.32±0.37 10.57±1.02 60.23±7.35 54.24±6.97 40.36±7.29 33.65±4.21 22.37±3.61 25.63±5.31模型組8 7.36±0.42△16.32±1.87△45.37±5.96△40.68±5.74△35.39±3.32△23.54±4.31△19.25±3.54 21.35±5.24丹參酮組10 6.01±0.34*14.24±1.72 63.64±8.25*43.25±7.95 71.01±8.65*37.52±3.97 17.32±3.70 19.33±2.94

2.4各組大鼠定位航行試驗(yàn)比較見表3。模型組大鼠潛伏期及游泳距離明顯增多，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮組大鼠治療后大鼠潛伏期及游泳距離明顯明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5各組大鼠海馬NO、MDA和SOD水平比較見表4。模型組大鼠MDA和NO明顯增高，SOD明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮組大鼠治療后MDA和NO明顯降低，SOD明顯增高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組大鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表3　各組大鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05。下同。

組別時(shí)間潛伏期（s）游泳距離（cm）對(duì)照組1 d 49.54±22.13 841.07±78.21 （n=10）7 d 32.01±22.2 450.47±72.14 15 d 26.21±21.14 240.42±52.19模型組1 d 156.85±23.24 839.03±87.89 （n=8）7 d 123.87±18.37△741.13±72.31△15 d 131.62±20.51△786.13±61.75△丹參酮組1 d 150.24±21.75 827.05±77.65 （n=10）7 d 102.23±15.02*524.56±79.72*15 d 71.02±11.24*326.54±45.37*

表4　各組大鼠海馬NO、MDA和SOD水平比較（±s）

表4　各組大鼠海馬NO、MDA和SOD水平比較（±s）

組別時(shí)間SOD（U/L）對(duì)照組治療前140.04±15.71 （n=10）治療后141.50±15.21模型組治療前58.71±6.31 NO（nmoL/mL）MDA（nmoL/mL）7.24±0.21 6.41±0.30 8.50±0.29 5.96±0.20 18.21±10.39 25.30±3.49 （n=8）治療后61.51±10.05△21.51±12.75△24.89±2.27△丹參酮組治療前19.30±12.17 27.97±4.37 59.09±6.12 （n=10）治療后9.21±0.27*11.24±1.75*127.20±15.2*

3　討論

CP是繼脊髓灰質(zhì)炎被控制后造成小兒肢體殘疾的主要疾病，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)切除部分大腦皮質(zhì)來(lái)破壞脊髓中央前回及中央后回，從而破壞大部分對(duì)側(cè)軀體的感覺及運(yùn)動(dòng)中樞，引起上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元麻痹，制造大腦皮質(zhì)及部分大腦髓質(zhì)小兒腦癱類似的脊髓灰質(zhì)損傷，以模擬CP相似病理改變和臨床癥狀。因是腦組織出現(xiàn)病理性改變，故臨床以持續(xù)存在的中樞性運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)發(fā)育障礙、活動(dòng)受限［8］。本實(shí)驗(yàn)中采用國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)行為學(xué)檢測(cè)方法鑒定方法作為CP模型的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，水迷宮儀進(jìn)行定位航行和空間探索試驗(yàn)，懸吊試驗(yàn)和斜坡試驗(yàn)可直觀反應(yīng)大鼠行神經(jīng)行為學(xué)改變［9］。實(shí)驗(yàn)顯示，比照對(duì)照組，模型組大鼠肢體活動(dòng)少、跛行、左前肢及左前爪屈曲痙攣、精神及自潔情況差，攝食及飲水量減少，2只死亡。神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)靈活性降低，穩(wěn)定性差，右側(cè)肢體無(wú)力顫抖。懸吊試驗(yàn)很快掉落桌，斜坡試驗(yàn)反應(yīng)遲緩，不能及時(shí)將頭轉(zhuǎn)向上方，學(xué)習(xí)找平臺(tái)所需的次數(shù)和時(shí)間明顯增多，第1、2象限停留時(shí)間明顯降低，大鼠在中環(huán)停留長(zhǎng)于內(nèi)環(huán)和外環(huán)。潛伏期及游泳距離明顯增多，以上現(xiàn)象說(shuō)明造模成功，造模后隨意運(yùn)動(dòng)障礙、學(xué)習(xí)記憶能力下降。丹參酮組在治療后，較模型組明顯好轉(zhuǎn)，大鼠肢體活動(dòng)、精神、自潔情況、攝食及飲水量明顯增多，無(wú)動(dòng)物死亡。神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)懸吊試驗(yàn)時(shí)間增加，斜坡試驗(yàn)反應(yīng)較模型組敏捷，將頭轉(zhuǎn)向上方用時(shí)、學(xué)習(xí)找平臺(tái)所需的次數(shù)和時(shí)間明顯減少，大鼠在第1象限和中環(huán)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，潛伏期及游泳距離明顯減少，提示治療后隨意運(yùn)動(dòng)障礙、學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。

丹參酮是從丹參中純化分離出的二萜醌類化合物［10］。丹參味辛、性涼、具涼血消癰、活血通經(jīng)［11］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亦證實(shí)丹參中的丹參素及丹參酮具有活血化瘀的藥效，藥物吸收后可通過(guò)擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量，提高抗凝和纖溶活性，降低血液黏滯度，減少血小板聚集，改善血流動(dòng)力學(xué)而達(dá)到抗組織缺血缺氧狀態(tài)［12］。同時(shí)，通過(guò)增強(qiáng)SOD活性達(dá)到消除氧自由基及減少腦組織興奮性氨基酸的釋放，降低應(yīng)激性而發(fā)揮組織保護(hù)作用［13］。有研究表明，造成CP病理改變是神經(jīng)細(xì)胞淀粉（Aβ）合成過(guò)多造成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，引起腦組織不溶性淀粉樣沉積而形成斑塊［14］。而MDA可使溶解狀態(tài)下Aβ的轉(zhuǎn)化為聚集態(tài)的Aβ加速腦內(nèi)的沉積和纏結(jié)而加重CP的臨床癥狀［15］。模型組大鼠記憶力明顯下降并出現(xiàn)認(rèn)知功能和肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力減退，其主要原因就是MDA上調(diào)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。而丹參酮組治療后SOD升高，SOD可減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，有效對(duì)抗MDA上調(diào)，明顯改善大鼠智力障礙，增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)記憶能力。其機(jī)制可能與丹參酮減少淀粉樣沉積、加速斑塊的清除、提高大鼠的抗氧化能力、清除機(jī)體過(guò)多的氧自由基、抑制自由基損傷、減輕機(jī)體組織和細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程和細(xì)胞毒作用有關(guān)［16］。另有研究表明NO生成過(guò)量時(shí)會(huì)通過(guò)與脂肪、蛋白質(zhì)、核酸等相互作用，破壞機(jī)體細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生毒性作用［17］。而NO過(guò)量生成會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)Aβ聚集加重對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒，加重腦組織損害，丹參酮可能在這個(gè)過(guò)程中阻滯某一階段，減少自由基產(chǎn)生而緩解CP疾病發(fā)展。

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Ef fect of Intracerebroventricular Injection of Tanshinone on Neurobehavioral M odel of Cerebral Palsy Rats

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R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）07-1281-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.005

湖北省科技廳項(xiàng)目（2013BCB002）
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2016-03-04）（

2015-11-07）