馬小珍 童文彬 劉李 曹冉冉 陳娜

610041成都，四川省疾病預防控制中心

2007-2014年柯薩奇病毒B5四川分離株的基因特征分析

馬小珍 童文彬 劉李 曹冉冉 陳娜

610041成都，四川省疾病預防控制中心

目的 了解2007-2014年四川省急性弛緩性麻痹（acute f1accid para1ysis，AFP）病例中柯薩奇病毒B組5型（Coxsackie virus B5，CVB5）的基因特征。方法 對四川省2007～2014年AFP病例中分離到的10株CVB5進行全VP1區(qū)逆轉錄-聚合酶鏈（RT-PCR）反應擴增和核苷酸序列測定，構建遺傳進化樹進行基因特征分析。結果 10株分離株均為D基因型，與CVB5原型株（Fau1kner株）之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為80.4%～81.9%和95%～97.1%。2014年1株資陽分離株和1株成都分離株VP1區(qū)氨基酸序列完全一致，1株南充分離株和1株宜賓分離株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性均為100%。結論 2007-2014年四川地區(qū)AFP病例中分離到的CVB5為D基因型，且遺傳特性較為穩(wěn)定。

【主題詞】 急性馳緩性麻痹；柯薩奇病毒B組5型；基因特征分析

腸道病毒（EV）隸屬小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，為單股正鏈的無包膜RNA病毒，包括脊髓灰質炎病毒、?？刹《尽⒖滤_奇病毒及新型腸道病毒，根據(jù)生物學及遺傳特性分為（A、B、C、D）4個組［1］。EV感染可引起麻痹性疾病、無菌性腦膜炎、心肌疾病、手足口病、急性出血性結膜炎、肝炎、出疹性疾病、嬰兒腹瀉和胰島素依賴型糖尿病等多種疾病，還可引起一些諸如發(fā)熱等類似感冒的綜合病癥［2，3］。多數(shù)HEV都可引起肢體麻痹，特別是脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒和?？刹《荆渲屑顾杌屹|炎病毒感染后可造成肌張力減弱、肌力下降、腱反射減弱或消失，留下嚴重后遺癥；柯薩奇病毒和埃可病毒與脊髓灰質炎病毒臨床癥狀相似，但較脊灰發(fā)病輕，一般沒有殘留麻痹。

柯薩奇 B組病毒（Coxsackieviruses group B，CVB）分為CVB1～CVB6六個血清型，均能在人群中引起小范圍的流行，進一步研究還發(fā)現(xiàn)CVB和一些慢性疾病的發(fā)生密切相關?？滤_奇病毒B5（CVB5）感染可引起多種人類疾病，包括無菌性腦膜炎、肌肉麻痹、病毒性心肌炎、手足口病、胰腺炎和糖尿病等，在我國均有報道［4］。

急性弛緩性麻痹（acute f1accid para1ysis，AFP）病例監(jiān)測系統(tǒng)是以消滅脊髓灰質炎為目的而建立的一個監(jiān)測系統(tǒng)，而AFP病例的診斷要點為急性起病、肌張力減弱、肌力下降、腱反射減弱或消失。而其他HEV感染也可引起這些癥狀的出現(xiàn)，因此每年都可從AFP病例的糞便標本中分離到大量的非脊灰腸道病毒，即可以利用AFP病例監(jiān)測系統(tǒng)作為一種便捷有效的腸道病毒監(jiān)測手段。

因病毒主要的免疫原性蛋白和中和抗原決定簇位點在VP1上，對VP1區(qū)的研究能夠用于腸道病毒分子分型和進化分析［5，6］。本研究通過對四川省2007-2014年AFP病例中分離到的CVB5進行VP1區(qū)基因序列分析和分子流行學特征分析，回顧性研究CVB5不同基因亞型的時間分布和地區(qū)分布，進一步了解病毒的傳播動態(tài)。

1 材料與方法

1.1標本來源 所用標本來源于2007-2014年四川省AFP病例糞便標本，由縣區(qū)級疾病預防控制中心采集，冷藏運送至省級疾病預防控制中心實驗室，-20℃冷藏保存。

1.2病毒分離 所有糞便標本均按照WHO《脊髓灰質炎實驗室手冊》第四版方法用RD（人橫紋肌肉瘤細胞）、L20B（轉人脊灰病毒受體的小鼠肺細胞）細胞進行細胞培養(yǎng)、病毒分離，病毒陽性分離物-80℃冷藏保存［7］。實驗前接種RD細胞進行病毒增殖。

1.3病毒鑒定 采用微量中和試驗法確定病毒型別（腸道病毒組合血清由中國疾病預防控制中心病毒病所脊灰實驗室提供）。

1.4RNA提取 采用Promega Maxwe11 16核酸自動提取儀進行病毒RNA提取。按照說明書從200 μ1的細胞培養(yǎng)物中提取50 μ1的病毒RNA，-80℃冷藏保存。

1.5VP1區(qū)RT-PCR及序列測定 RT-PCR反應采用Invitrogen公司的Super Script III One-step RTPCR System試劑盒，使用引物490/492和491/493分段進行全VP1區(qū)的核苷酸序列擴增［6］。反應條件為：反轉錄45℃25 min，預變性94℃2 min，變性94℃15 s，退火48℃30 s，延伸65℃1.5 min，共40個循環(huán)，最后65℃5 min延伸。目的基因片段大小分別為700 bp和750 bp，在毛細管電泳上鑒定后用Wizard SV Ge1 and PCR C1eanup System（Promega）按廠家說明書進行純化。純化PCR產物用相同引物分別進行雙向標記，標記試劑為Bigdye Terminator v3.1 Cyc1e Sequencing Kit（App1ied Biosystems），反應條件為：變性96℃ 10 s，退火50℃ 5 s，延伸60 ℃ 4 min，共 25個循環(huán)。標記產物用 BigDye XTerminator Purification Kit（App1ied Biosystems）再次純化后，在 3500 XL Genetic Ana1yzer（App1ied Biosystems）上完成測序。

1.6序列分析 序列用Sequencher 5.0和Bioedit 7.0.9.0軟件編輯處理，使用NCBI中BLAST程序初步確定血清型，對所有毒株的全VP1序列進行同源性分析，采用 Mega6.0軟件進行遺傳進化分析（Kimura 2參數(shù)模型，鄰位 -連接法，1000次bootstrap檢驗）。

2 結果

2.1病毒分離與鑒定 2007-2014年共采集的AFP病例糞便標本2889份，分離到病毒陽性分離物313株，分離率為10.8%。所有毒株均已用腸道病毒組合血清和VP1區(qū)基因序列完成分型鑒定。其中腸道病毒A組8個型別，CVA4、CVA10、EV-A71這三個型別共占所有腸道病毒A組的78.38%；腸道病毒B組最多共24個型別，E14、E11、E6、CVB3、CVB5、E13較多；腸道病毒C組僅有2個型別，為CVA21和CVA24。在313株中，10株病毒陽性分離物被鑒定為CVB5，其中2007年分離到1株，分離率為0.03%（1/330）；2010年分離到1株，分離率為0.03%（1/338）；2014年分離到 8株，分離率為0.20%（8/396）；其余年份未分離到CVB5。所有序列均已上傳至 GenBank，登錄號為 LC120343～LC120352。CVB5相關病例的地區(qū)分布、麻痹時間、診斷結果見表1。

2.2同源性分析 本次分離到的10株CVB5的VP1區(qū)全長849 bp，編碼283個氨基酸，與原型株（Fau1kner）相比，無堿基的插入和缺失，在氨基酸序列上共有17個位點發(fā)生變異，其中有8個位點是10株同時變異，另外9個位點有部分分離株發(fā)生變異。與原型株之間的核苷酸同源性為80.4% ～81.9%，氨基酸同源性為95% ～97.1%。這10株CVB5分離株之間的核苷酸同源性為 89.8% ～100%，氨基酸同源性為97.1% ～100%，其中14-1 和14-320VP1區(qū)核苷酸同源性和氨基酸同源性均為100%，而14-235和14-324的VP1區(qū)氨基酸序列完全一致。

表1　四川省CVB5分離株相關AFP病例的地區(qū)分布、麻痹時間和診斷結果Tab.1 Endemic distribution，time of para1ysis and c1inica1 diagnosis of CV5 re1ated AFP cases

2.3進化樹分析 以CVB3原型株（Nancy株）和埃可病毒15型（Echovirus 15，E15）CH96—51株為外對照，將分離到的10株病毒與GenBank中檢索到的19條CVB5的VP1區(qū)核苷酸序列構建親緣進化樹，以此明確四川省CVB5分離株的遺傳進化規(guī)律以及同國內外CVB5分離株的親緣關系，見圖1。進化樹分析表明，CVB5劃分為A、B、C、D 4個基因型。A基因型只包括原型株Fau1kner/AF114383株；B基因型主要為在歐美多個國家流行的毒株；C基因型包括我國山東省和韓國的兩株分離株Shandong/ CHN/GQ329771和KOR/AY875692，與他們同源性最近的還有3株豬水皰病毒（swine vesicu1ar disease viruses，SVDV）。10株四川省CVB5分離株均屬于D基因型。

3 討論

在CVB中，CVB5是引起人類疾病的最常見血清型。CVB5已在世界范圍內廣泛流行，且有較高的感染率，近年我國山東省、河南省、浙江省、云南省等均報道過由CVB5引起的無菌性腦膜炎暴發(fā)和散發(fā)［8-10］，福建省、安徽省也報道過從手足口病例中分離到CVB5［11，12］。本次研究的10例由CVB5感染引起的相關AFP病例中，5例診斷為格林巴列綜合征，4例診斷為肌炎，還有1例診斷為非脊灰腸道病毒感染。回顧性研究限制了我們得到更多的臨床相關信息，但仍然可以幫助我們確定CVB5能夠引起麻痹性疾病。

▲為CVB5四川分離株圖1　CVB5全VP1區(qū)序列進化樹▲represents Sichuan iso1atesFig.1 Phy1ogenetic ana1ysis of VP1 region of CVB5

從2007-2014年四川省AFP病例標本分離到的10株CVB5中，2014年一共分離到8株，占CVB5分離株的80%。鑒于AFP監(jiān)測沒有涵蓋CVB5可引起的所有病征，且由于腸道病毒為隱性感染，只有0.1%～1%的感染者會出現(xiàn)臨床癥狀，說明2014年四川省CVB5的感染者大約在800～8000例，提示2014年四川省腸道病毒的優(yōu)勢基因型可能變?yōu)镃VB5，并在四川省呈現(xiàn)流行狀態(tài)。而在2014年的8株分離株中，1株資陽分離株和1株成都分離株VP1區(qū)氨基酸序列完全一致，成都市與資陽市相鄰；1株南充分離株和1株宜賓分離株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性均為100%，而南充市和宜賓市行政區(qū)域未接壤，說明CVB5不僅可以在相鄰區(qū)域傳播，還可以跨區(qū)域傳播。

本研究中的10株CVB5分離株在VP1區(qū)氨基酸序列上與原型株相比，在第7、75、90、91、125、132、268和273氨基酸位點均發(fā)生了變異，同法國、韓國以及我國浙江、山東、云南等地的分離株一致。而在第3位和第80位上，有4株的氨基酸從P和K變?yōu)門和R；在第19位和第54位，有1株由G和K分別變?yōu)镋和R；在第95位，7株分離株的氨基酸從N變異為S；第200位有5株從R變?yōu)镵；在244位，有1株由V變?yōu)镮；在第259和第278位，有1株由K和T變異為M和I。關于病毒序列變異與病毒毒力和臨床致病性的關系是近年臨床和分子生物工作者努力研究的課題，但本研究中CVB5的VP1氨基酸變異與臨床表現(xiàn)的確切關系不明，可能與以下因素有關：首先VP1蛋白是EV的主要結構蛋白，關鍵部位氨基酸的變化可能會引起病毒空間結構的變化，從而導致病毒毒力變化；其次VP1序列變異對感染機體的某些免疫活性細胞和活性分子的調控基因和結構基因的表達可能會產生影響；最后本研究是從AFP病例中得到的分離株，由于CVB5能夠引起的疾病種類較多，這些氨基酸位點的變化會否引起其他疾病臨床表現(xiàn)不同還需要進一步研究。

VP1區(qū)核苷酸序列親緣進化樹顯示CVB5在地理和時間分布上有一定的聚集性，A基因型僅有1950年分離的原型株Fau1kner株；B基因型主要為1985-2002年在歐美多個國家流行的毒株；C基因型于20世紀70年代中期至20世紀末在亞洲流行，與他們同源性最近的SVDV在抗原性上與CVB5相似，一般只在豬中間流行，不引起人類發(fā)病；D基因型是目前在世界范圍內流行的基因型，包括芬蘭、法國、韓國等均分離到 D基因型［13，14］，我國山東、浙江、云南、河南等地的分離株也為D基因型。本次分離到的10株CVB5四川分離株均屬于D基因型，與我國及世界流行情況相符。且這10株分離株親緣關系都較近，說明四川省CVB5遺傳特性較為穩(wěn)定。而07年瀘州分離株和10年瀘州分離株親緣關系很近，說明CVB5在瀘州地區(qū)從2007年到2010年可能發(fā)生持續(xù)流行且遺傳特性穩(wěn)定。

本研究利用AFP病例監(jiān)測系統(tǒng)對CVB5進行

監(jiān)測，了解其基因特征和流行情況，有助于CVB5相關疾病的預防和控制。

［1］ 19 Internationa1CommitteeonTaxonomyofViruses. Picornaviridae.Virus Taxonomy：C1assification and Nomenc1ature of Viruses：Report of the Internationa1 Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego：E1sevier，2011.

［2］ Richman DD，Whit1ey 1L1，Hayden FG.C1inica1 Viro1ogy. Phi1ade1phia：Lippincott Raven，2001.

［3］ 黃輝，鄧莉，鄭崇光，等.柯薩奇病毒A6型所致手足口病臨床特征分析.中華實驗和臨床病毒學雜志，2015，29：443-446.doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.05.014.

［4］ 葛瓊，嚴菊英，龔黎明，等.浙江省2008年病毒性腦膜腦炎病原柯薩奇B組5型病毒VPI區(qū)基因變異分析.中國疫苗和免疫，2010，16：38-43.

［5］ Oberste MS，Maher K，Ki1patrick DR，et a1.Mo1ecu1ar evo1ution of the human enteroviruses：corre1ation of serotype with VP1 sequence and app1ication to picornavirus c1assification.Viro1，1999，73：1941-1948.

［6］ Oberste MS，Maher K，Wi11iams AJ，et a1.Species-specific RTPCR amp1ification of human enteroviruses：a too1 for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses.J Gen Viro1，2006，87：119-128.

［7］ Wor1d Hea1th Organization.Po1io Laboratory Manua1，4th edn. Geneva：WHO，2004.

［8］ 王海巖，李巖，徐愛強，等.柯薩奇B5病毒引起山東省一起無菌性腦膜炎暴發(fā)的鑒定及其親緣進化分析.中華流行病學雜志，2010，31：64-68.doi：10.3760/cma.j.issn.0254-6450. 2010.01.016.

［9］ 黃學勇，穆玉姣，李幸樂，等.一起暴發(fā)性病毒性腦炎的病原學調查.中華預防醫(yī)學雜志，2011，45：830-832.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2011.09.014.

［10］ 李華，楊卉娟，柯華昕，等.一株柯薩奇病毒B組5型（Cox. B5）病毒的分離及VP1基因分析.醫(yī)學研究雜志，2011，40：55-58.doi：10.3969/j.issn.1673-548X.2011.09.018.

［11］ 翁育偉，周朝暉，陳煒，等.2010年福建省手足口病患者中柯薩奇B5病毒的序列分析.中國人獸共患病學報，2011，27：1086-1089.doi：10.3969/j.issn.1002-2694.2011.12.005.

［12］ 史永林，張永根，胡萬富.柯薩奇B5型病毒安徽分離株的鑒定及VP1區(qū)基因特性分析.中國病原生物學雜志，2014，9：979-1028.

［13］ Mirand A，Henque11 C，Archimbaud C，et a1.Prospective identification of enteroviruses invo1ved in meningitis in 2006 throughdirectgenotypingincerebrospina1f1uid.JC1in Microbio1，2008，4：87-96.

［14］ Baek K，Park K，Jung E，et a1.Mo1ecu1ar and epidemio1ogica1 characterization of enteroviruses iso1ated in chungnam，Korea from 2005to2006.JMicrobio1Biotechno1，2009，19：1055-1064.

Genetic characteristics of Coxsackie virus B5 isolates in Sichuan province over 2007-2014

MaXiaozhen，Tong Wenbin，Liu Li，Cao Ranran，Chen Na Sichuan Center for Disease Control and Prevention，Chengdu 610041，China

Chen Na，Email：emmanana@163.com

Objective To investigate genetic characteristics of Coxsackie virus B5（CVB5）in acute f1accid para1ysis（AFP）cases in Sichuan Province.Methods 10 CVB5 strains iso1ated from stoo1 samp1es of AFP cases in Sichuan Province over 2007-2014 were subjected to entire VP1 coding region amp1ification by reverse transcription-po1ymerase chain reaction（RT-PCR）and nuc1eotide sequencing，and phy1ogenetic tree was constructed for genetic characterization.Results A11 of the 10 strains were identified as genogroup D.The nuc1eotide and the amino acid homo1ogies were 80.4%-81.9%and 95%-97.1%，which compared with the Fau1kner prototype strain.The amino acid homo1ogies between Ziyang strain and Chengdu strain obtained in 2014 were 100%，respective1y.The nuc1eotide and the amino acid homo1ogies between Nanchong iso1ate and Yibin iso1ate obtained in 2014 were both 100%，respective1y.Conclusions The iso1ates from AFP cases in Sichuan Province over 2007-2014 were be1ong to genogroup D.The genetic characteristics of 10 strains were stab1e.

Acute f1accid para1ysis；Coxsackie virus B5；Genetic characteristics ana1ysis

陳娜，Emai1：emmanana@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.012

2015-12-23）