魏煒 晉俊濤 張寶云 宋韞韜 張乃嵩 董小平 石琦

100142北京，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所頭頸外科惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（魏煒、宋韞韜、張乃嵩）；450000河南，鞏義市人民醫(yī)院（晉俊濤）；102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒室傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張寶云、董小平、石琦）

PrP蛋白的表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者臨床進(jìn)展及病理分級的關(guān)系

魏煒 晉俊濤 張寶云 宋韞韜 張乃嵩 董小平 石琦

100142北京，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所頭頸外科惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（魏煒、宋韞韜、張乃嵩）；450000河南，鞏義市人民醫(yī)院（晉俊濤）；102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒室傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張寶云、董小平、石琦）

目的 了解頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者PrP蛋白的表達(dá)與臨床進(jìn)展及病理分級的關(guān)系。

方法 在92例臨床診斷的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中，通過免疫組化的方法對PrP蛋白在組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測，同時(shí)對PrP蛋白與患者臨床進(jìn)展及病理分級程度的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 在92例臨床診斷的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中，PrP蛋白在腫瘤發(fā)生的不同部位其陽性率不同，隨著患者的臨床病程的進(jìn)展其陽性率增高，隨著腫瘤的病理分級的嚴(yán)重其陽性率增高。結(jié)論 PrP蛋白的高表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

【主題詞】 頭頸癌；腫瘤鱗狀細(xì)胞；PrP蛋白

Fund programs：SKLID Deve1opment Grant（2015SKLID503，2015SKLID303）；Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（81301429，81572048）

頭頸部惡性腫瘤是一種常見的惡性腫瘤，以鱗癌為主，包括口腔、喉、口咽及下咽等部位，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)近年來頭頸部惡性腫瘤的發(fā)生有逐漸上升的趨勢，但其發(fā)生和發(fā)展的具體機(jī)制仍不清楚［1］。朊蛋白（PrP）它對神經(jīng)元的粘附、分化和生存具有重要意義，但對其在神經(jīng)系統(tǒng)外的功能所知甚少［2］。有文獻(xiàn)報(bào)道PrP蛋白的表達(dá)與胃癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究PrP蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)以及與其發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，開展了此次研究。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源及處理 所有病例樣本的收集及病例的臨床和病理資料均來自北京腫瘤醫(yī)院頭頸外科2006-2011年就診的患者，一共92份頭頸部腫瘤的樣品，包括63份喉癌、5份口咽癌、15份下咽癌、9份唇癌樣本。標(biāo)本采集征得患者同意，本研究獲北京腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查通過。抗朊蛋白抗體3F4來自Mi11ipore公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自中山生物技術(shù)公司，其余試劑均為分析純。采用免疫組織化學(xué)方法：石蠟包埋的組織塊切成5 μm厚的切片，充分烘烤。按下列步驟處理：常規(guī)二甲苯、酒精脫蠟至水，3%H2O2封閉10 min，PBS沖洗5 min，置于檸檬酸液中，在微波爐大火95℃下修復(fù)5 min，用1%正常羊血清封閉30 min，PBS沖洗，然后加入朊蛋白特異性抗體3F4（1∶500稀釋），4℃作用過夜，PBS沖洗，加入羊抗鼠二抗孵育，30 min后再用PBS沖洗，DAB顯色。切片用蘇木素復(fù)染、脫水以及用封片劑進(jìn)行封片觀察。實(shí)驗(yàn)中用PBS代替一抗作為陰性對照［3］。

1.2PrP蛋白免疫組織化學(xué)染色程度的確定 PrP

蛋白免疫組織化學(xué)染色程度確定標(biāo)準(zhǔn)如下：每張石蠟切片在顯微鏡下隨機(jī)選定5個(gè)視野，由陽性的細(xì)胞數(shù)及染色程度進(jìn)行分級評分。10%細(xì)胞染色定為0分；10%～25%細(xì)胞染色定為1分；25%～50%細(xì)胞染色定為2分；50%～75%細(xì)胞染色定為3分；＞75%細(xì)胞染色定為4分。另外，針對染色程度，無陽性染色定為0分；細(xì)胞內(nèi)有淺棕色信號定為1分；細(xì)胞內(nèi)有中等棕色信號定為2分；細(xì)胞內(nèi)有深棕色信號定為3分。最后PrP蛋白免疫組織化學(xué)染色程度的劃分依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)及染色程度相加的結(jié)果判定：0-1分為陰性（-）；2-4分為弱陽性（+）；5-8分為陽性（++）；9-12分為強(qiáng)陽性（+++）［4］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差檢驗(yàn)及四格表精確檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1PrP蛋白的免疫組化染色結(jié)果 本研究中共有92份樣品應(yīng)用3F4抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，其中共有51個(gè)病例（51/92，55.43%）為PrP蛋白免疫反應(yīng)陽性。在喉癌當(dāng)中的陽性率為58.73%（37/ 63），在下咽癌中的陽性率為46.47%（7/15），在上咽癌中的陽性率為60%（3/5），在唇癌當(dāng)中的陽性率為44.44%（4/9）。其中口咽癌和唇癌的陽性率相比（P=0.0015＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；下咽癌和唇癌的陽性率相比（P=0.6549＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；喉癌和唇癌的陽性率相比（P= 0.0037＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；喉癌和口咽癌的陽性率相比（P=0.7964＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；喉癌和下咽咽癌的陽性率相比（P=0.0143＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2PrP蛋白的表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期有關(guān) 病例按照不同臨床分期中的PrP染色結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：PrP蛋白的陽性率表達(dá)在I期中為44.44%（12/27），II期中為62.86%（22/ 35），III期中為 56.00% （14/25），IV期中為60.00%（3/5）。臨床I期的PrP蛋白的陽性率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于II期（P=0.0001）、III期（P=0.0199）和IV期（P=0.0015）。在II期、III期及IV期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3PrP蛋白的表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的病理分級有關(guān) 92份病例中，PrP蛋白的陽性表達(dá)在高分化病例中為30.77%（8/26），在中分化病例中為60.78%（31/51），在低分化病例中為80.00%（12/ 15），見表3，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高度提示PrP蛋白的表達(dá)與頭頸部鱗癌的分化程度有著相關(guān)性。

3 討論

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法對PrP蛋白檢測進(jìn)行檢測，PrP蛋白的總陽性率達(dá)到55.43%。PrP蛋白的陽性率及染色強(qiáng)度與腫瘤的病理分級密切相關(guān)。同時(shí)，PrP蛋白的陽性率與腫瘤的解剖部位、臨床分期都有關(guān)系。

PrP蛋白在人類惡性腫瘤中的作用也越來越引起人們的關(guān)注。很多的文獻(xiàn)都支持PrP蛋白的過表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，包括腸癌、胃癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌。而且，在很多腫瘤細(xì)胞系中，都發(fā)現(xiàn)有PrP蛋白的過表達(dá)，包括黑色素瘤及肝癌等的腫瘤細(xì)胞系［5］。但是，PrP蛋白在鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

PrP蛋白在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞腺癌的表達(dá)率為40%，而在胰腺腺管內(nèi)上皮瘤（PIN-3）中僅為15%，在PIN-2、PIN-1中沒有PrP蛋白的表達(dá)［5］。PrP蛋白的高表達(dá)率在肺癌和胃癌中同樣也有描述［6］。更重要的是PrP蛋白的表達(dá)似乎與胰腺癌的惡性度有關(guān)。與以上結(jié)果一致，我們的研究也發(fā)現(xiàn)PrP蛋白的陽性率與染色強(qiáng)度與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展有密切關(guān)系，特別是腫瘤的病理分級，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了PrP蛋白腫瘤組織中的重要作用。

表1　頭頸部鱗狀細(xì)胞癌病例中PrP蛋白檢測及其與臨床進(jìn)展和病理分級的關(guān)系Tab.1 PrP-positive staining in the HNSCC cases and its staining based on c1inica1 degrees and patho1ogica1 degrees

都與細(xì)胞存活、增殖和分化密切相關(guān)［7］。然而大多數(shù)的研究包括本研究在內(nèi)都發(fā)現(xiàn)腫瘤中的PrP蛋白是單糖基化形式的蛋白，而且只存在于細(xì)胞漿而不錨定在細(xì)胞膜上。實(shí)際上，胞漿中單糖基化PrP蛋白的積累通常會導(dǎo)致許多種類細(xì)胞系的生存能力的下降。近年來，對于PrP在腫瘤發(fā)生中的作用也提出許多機(jī)制，例如在胃癌當(dāng)中，PrP的增加導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路的激活，從而上調(diào)Cyc1in D的含量而起作用［8］。藥物抵抗MCF7肺癌細(xì)胞中化療藥物導(dǎo)致PrP蛋白與P糖蛋白相互結(jié)合而發(fā)揮作用［9］；在黑色素瘤及胰腺癌中通過PrP蛋白與細(xì)絲蛋白A的相互作用來發(fā)揮作用。那么，對于PrP蛋白功能更好地詮釋能夠幫助理解它在不僅海綿狀腦病，而且還有腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。

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The relationship between PrP protein expression and the clinical degrees and the pathological grade of head and neck sq
uamous cell carcinomas

Wei Wei，Jin Juntao，Zhang Baoyun，Song Yuntao，ZhangNaisong，Dong Xiaoping，Shi Qi Key laboratory of Carcinogenesis and Translational Research（Ministry of Education），Head and Neck Surgery Department，Peking University Cancer Hospital&Institute，Beijing 100142，China（Wei W，Song YT，Zhang NS）；Gongyi City People's Hospital，Renmin RD，Henan 450000（Jin J）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Zhang BY，Dong XP，Shi Q）

Shi Qi，Email：shiqi76@126.com

ObjectiveTo ana1yze the PrP protein expression and the c1inica1 degrees and patho1ogica1 grade of head and neck squamous ce11 carcinomas.Methods Immunohistochemistry technique was used to test the PrP protein expression in the 92 head and neck squamous ce11 carcinomas cases.SPSS software was used to ana1yze the re1ationship between the PrP protein and the c1inica1 degrees and patho1ogica1 grade of head and neck squamous ce11 carcinomas.Results In the 92 head and neck squamous ce11 carcinomas cases，the positive rate of PrP protein was different with the sites of the carcinomas，the c1inica1 degree and the patho1ogica1 grade.Conclusion High expression of PrP protein re1ated with the occurrence and deve1opment of head and neck squamous ce11 carcinomas.

Head and neck cancer；Neop1asms，squamous ce11；PrP Protein

傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題（2015SKLID503，2015SKLID303）；國家自然基金（81301429，81572048）

石琦，Emai1：shiqi76@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.003

2016-03-07）