孫靜 王晶 陳利娜 楊曉東 肖康 陳操 田嬋 石琦 董小平

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒病室傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在朊病毒感染細(xì)胞模型SMB-S15中抑制的研究

孫靜 王晶 陳利娜 楊曉東 肖康 陳操 田嬋 石琦 董小平

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒病室傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 檢測經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在朊病毒感染的細(xì)胞模型SMB-S15中的功能狀態(tài)。方法 運(yùn)用rea1 time-PCR方法檢測了朊病毒感染的細(xì)胞模型SMB-S15中，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控的靶基因mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用Western B1ot方法檢測穩(wěn)定感染羊瘙癢因子Chand1er株的小鼠神經(jīng)細(xì)胞系SMB-S15中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)調(diào)控蛋白及靶蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與磷酸戊聚糖治愈的細(xì)胞對照SMB-PS相比，SMB-S15細(xì)胞中經(jīng)典Wnt信號通路的靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin轉(zhuǎn)錄水平均有顯著下調(diào)。經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控蛋白中，磷酸化β-catenin （Ser33，37，Thr41）表達(dá)明顯上調(diào)，且其靶基因cyc1in D1的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，失活形式磷酸化糖原合成激酶（GSK-3β Ser9）表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論 在朊病毒感染的細(xì)胞模型SMB-S15中經(jīng)典Wnt/βcatenin信號通路被抑制。

【主題詞】 朊病毒??；Wnt/β-catenin信號通路；β-catenin；GSK-3β；靶基因

Fund programs：Chinese Nationa1 Natura1 Science Foundation（31270185，81301429，81572048）；SKLID Deve1opment Grant（2012SKLID102，2015SKLID503）

朊病毒病，又稱為傳染性海綿狀腦病，是一類可感染人及多種哺乳動(dòng)物的致死性神經(jīng)退行性疾病。目前認(rèn)為導(dǎo)致此疾病的感染因子是正常細(xì)胞中的朊蛋白的錯(cuò)誤折疊而形成的一種具有感染性且可抵抗蛋白酶K消化的PrPSc蛋白［1］。應(yīng)用P2X7受體激活劑ATP作用于感染朊病毒的小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系，可降低細(xì)胞中PrPSc的含量［2］。Wnt信號通路是一種廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中的高度保守的信號通路，是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化及成熟等過程的關(guān)鍵途徑［3］。

本研究以穩(wěn)定感染羊瘙癢因子Chand1er株的小鼠神經(jīng)細(xì)胞系SMB-S15為研究對象，分析了朊病毒感染的SMB-S15細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)。本研究為探索朊病毒致病的分子機(jī)制研究提供了新的思路，也為朊病毒病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫檢索小鼠cyc1in D1、c-myc、survivin序列，應(yīng)用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，并用primer-BLAST（NCBI）檢驗(yàn)引物特異性。引物序列見表1。

表1　Rea1 time-PCR引物及序列Tab.1 The primers of rea1 time-PCR

1.2cDNA的獲得 使用 Trizo1法提取細(xì)胞的RNA，測定RNA濃度，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（Promaga，#A3500），保存于-80℃。

1.3Real time-PCR反應(yīng) 配置20 μ1反應(yīng)體系：PowerSYBRGreenPCRMastermix（App1ied biosystems，4367659）10 μ1，上下游引物（10 μmo1/L）各0.5 μ1、cDNA 2.5 μ1 μ1、H2O 7 μ1。在 ABI 7900HT實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：50 ℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，55℃1 min（循環(huán)40次）；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.4細(xì)胞裂解液的制備 消化并重懸SMB-PS及SMB-S15細(xì)胞，2 000 r/min，4℃ 離心5 min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入含1%（v/v）蛋白酶抑制劑（Ca1biochem）的細(xì)胞裂解液（CW BioTech）重懸，冰上裂解1 h。2 000 r/min，4℃離心10 min，取上清測定細(xì)胞總蛋白濃度。如需測細(xì)胞中PrPSc，將細(xì)胞裂解液用終濃度為25 μg/m1的蛋白酶K 37℃消化1 h。

進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，進(jìn)行封閉和抗體雜交。所應(yīng)用的一抗：6D11（Santa Cruz Biotechno1ogy，sc-58581）、β-catenin（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#8480）、phosphor-β-catenin Ser33，37、Thr41（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#9561）、GSK-3β（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#12456）、phosphor-GSK-3β Ser9（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#5558）、cyc1in D1 （Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#2978）、β-actin（Santa Cruz Biotechno1ogy，Sr-47778）。相對應(yīng)的二抗是HRP標(biāo)記的抗鼠及抗兔 IgG 二抗（Jackson ImmunoResearch Labs，115-035-003、111-035-003）。ECL顯色，使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用均數(shù)加減平均標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異用t-test，???（P＜0.001），??（P＜0.01），?（P＜0.05），NS（P＞0.05）為無差異。

2 結(jié)果

2.1SMB-S15細(xì)胞中PrPSc的檢測 為確保朊病毒感染的SMB-S15細(xì)胞中PrPSc的存在，將提取的細(xì)胞裂解液用終濃度為25 μg/m1的蛋白酶K 37℃消化1 h，然后進(jìn)行Western B1ot檢測，一抗為PrP特異性單克隆抗體6D11。如圖1所示，經(jīng)蛋白酶K消化后，SMB-S15細(xì)胞中檢測到可抵抗蛋白酶K消化的PrPSc條帶。

圖1　SMB-S15及SMB-PS細(xì)胞中PrPSc的檢測Fig.1 Detection of the PrPScin SMB-S15 and SMB-PS ce11s

圖2　Rea1 time-PCR方法檢測SMB-S15及SMB-PS細(xì)胞中靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Detection of the mRNA 1eve1s of cyc1in D1，c-myc，surviving in SMB-S15 and SMB-PS ce11s by rea1 time-PCR

圖3　Western B1ot方法檢測SMB-S15及SMB-PS細(xì)胞中經(jīng)典Wnt相關(guān)蛋白Fig.3 Detection of the factors invo1ved in canonica1 Wnt signa1ing in SMB-S15 and SMB-PS ce11s by Western B1ot

2.2SMB-S15細(xì)胞模型中 cyclin D1、c-myc、survivin轉(zhuǎn)錄水平下調(diào) 為驗(yàn)證朊病毒感染細(xì)胞模型中經(jīng)典Wnt信號通路的靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin轉(zhuǎn)錄水平是否存在變化，我們以穩(wěn)定感染朊病毒Chand1er株的細(xì)胞系SMB-S15及經(jīng)磷酸戊聚糖治愈的細(xì)胞對照SMB-PS作為研究對象，應(yīng)用rea1 time-PCR方法對靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測。如圖2所示，與對照細(xì)胞SMB-PS相比，SMB-S15細(xì)胞中，cyc1in D1、c-myc、survivin的mRNA水平明顯下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3經(jīng)典Wnt信號通路的相關(guān)蛋白表達(dá)差異檢測

為進(jìn)一步驗(yàn)證朊病毒感染細(xì)胞模型中經(jīng)典Wnt信號通路的變化情況，我們對該通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了Western B1ot檢測。結(jié)果顯示，與SMB-PS相比，SMB-S15中 Ser33，37、Thr41位磷酸化的 βcatenin（p-β-catenin）表達(dá)明顯上調(diào)（圖3），且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GSK-3β及其Ser9位磷酸化的GSK-3β （p-GSK-3β）即失活形式檢測結(jié)果顯示，SMB-S15細(xì)胞中磷酸化GSK-3β Ser9表達(dá)水平與SMB-PS細(xì)胞相比有明顯的下調(diào)（圖3），且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果說明在朊病毒感染的細(xì)胞模型中失活形式的GSK-3β的表達(dá)下調(diào)，即GSK-3β的活性上調(diào)。SMB-S15細(xì)胞中經(jīng)典Wnt通路靶基因cyc1in D1的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（圖2），且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

經(jīng)典Wnt信號通路在神經(jīng)退行性變疾病中的作用逐漸受到重視，Wnt信號通路的失調(diào)與阿爾茲海默癥（A1zheimer's disease，AD）［5-7］的致病機(jī)理相關(guān)。而有文獻(xiàn)報(bào)道，載有姜黃素的納米粒子通過激活經(jīng)典Wnt通路而逆轉(zhuǎn)AD模型中的認(rèn)知障礙，促進(jìn)神經(jīng)再生［10］。

本研究以朊病毒感染的細(xì)胞模型SMB-S15為研究對象，運(yùn)用rea1 time-PCR方法檢測到經(jīng)典Wnt/ β-catenin信號通路調(diào)控的靶基因的轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)。同時(shí)，檢測了 SMB-S15細(xì)胞中經(jīng)典 Wnt/βcatenin信號通路的相關(guān)調(diào)控蛋白及靶蛋白的表達(dá)，磷酸化β-catenin（Ser33，37，Thr41）表達(dá)明顯上調(diào)，其通過蛋白酶體途徑被降解；而9位絲氨酸磷酸化的GSK-3β表達(dá)明顯下調(diào)，即失活形式的GSK-3β表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而表明GSK-3β的活性增強(qiáng)，可進(jìn)一步磷酸化β-catenin；Wnt通路的靶基因cyc1in D1的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。綜合以上基因水平及蛋白水平的檢測，表明在朊病毒感染的細(xì)胞模型SMB-S15細(xì)胞中，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路被抑制。

讓學(xué)生通過類比，反饋等比數(shù)列的相關(guān)性質(zhì)，有助于學(xué)生的理解記憶.與上文對應(yīng)，像等比數(shù)列的證明方法、等比數(shù)列的通項(xiàng)公式、等比數(shù)列的性質(zhì)“下標(biāo)和相等，積相等”，都可由類比得到.當(dāng)然，教師對等比數(shù)列的部分性質(zhì)，還要再與學(xué)生再解讀，提醒學(xué)生等比數(shù)列證明的嚴(yán)密性，如得到an=3an-1，要強(qiáng)調(diào)a1≠0；若證明到要強(qiáng)調(diào)an≠0.以及疊乘法的再認(rèn)識等等.

本研究分別從基因水平和蛋白水平分別證實(shí)在SMB-S15中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路被抑制，為探索朊病毒致病的分子機(jī)制提供了新的思路，也為朊病毒病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

［1］ Co1by D W，Prusiner S B.Prions.Co1d Spring Harb Perspect Bio1，2011，3：a006833.doi：10.1101/cshperspect.doi：a006833.

［2］ 王晶，張寶云，肖康，等.朊病毒感染與內(nèi)源性嘌呤受體P2X7相互關(guān)系的研究.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2015，29：216-218.doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.03.008.

［3］ Nusse R.Wnt signa1ing.Co1d Spring Harb Perspect Bio1，2012，4：a011163.doi：10.1101/cshperspect.a011163.

［4］ De Ferrari G V，Chacon M A，Barria M I，et a1.Activation of Wntsigna1ingrescuesneurodegenerationandbehaviora1 impairments induced by beta-amy1oid fibri1s.Mo1 Psychiatry，2003，8：195-208.doi：10.1038/sj.mp.4001208.

［5］ Bayod S，F(xiàn)e1ice P，Andres P，et a1.Downregu1ation of canonica1 Wnt signa1ing in hippocampus of SAMP8 mice.Neurobio1 Aging，2015，36：720-729.doi：10.1016/j.neurobio1aging.2014.09.017.

［6］ Purro S A，Ga11i S，Sa1inas P C.Dysfunction of Wnt signa1ing and synaptic disassemb1y in neurodegenerative diseases.J Mo1 Ce11 Bio1，2014，6：75-80.doi：10.1093/jmcb/mjt049.

［7］ Tiwari S K，Agarwa1 S，Seth B，et a1.Curcumin-1oaded nanopartic1es potent1y induce adu1t neurogenesis and reverse cognitive deficits in A1zheimer′s disease mode1 via canonica1 Wnt/beta-catenin pathway.ACS Nano，2014，8：76-103.doi：10.1021/nn405077y.

Remarkable impairment of Wnt/β-catenin signaling in prion infected cell model SMB-S15

SunJing，Wang Jing，Chen Lina，Yang Xiaodong，Xiao Kang，Chen Cao，Tian Chan，Shi Qi，Dong Xiaoping National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control；Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

Dong Xiaoping，Email：dongxp238@sina.com

Objective To investigate the functiona1 state of Wnt/β-catenin signa1ing in prion infected ce11 mode1.Methods Eva1uate a1terations in the factors invo1ved in the down-regu1ation of canonica1 Wnt signa1ing in prion infected ce11 1ine SMB-S15 by rea1 time-PCR and Western b1ot.Results Compared with the contro1 ce11 1ine SMB-PS，the transcriptions of Wnt/β-catenin signa1ing target genes cyc1in D1、c-myc、survivin were down-regu1ated in scrapie infected ce11 1ine SMB-S15 in the assays of rea1 time-PCR.Western b1ots revea1ed that the 1eve1s of phosphor-β-catenin Ser33，37，Thr41（p-β-catenin Ser33，37，Thr41）SMB-S15 ce11 1ine were much higher than that of SMB-PS ce11，whi1e that of cyc1in D1，one of the target genes of Wnt signa1ing，was decreased.The 1eve1 of phosphor-g1ycogen synthase kinase-3β（CGonSKc l-u3sβio）nSer9were marked1y reduced，representing an enhanced GSK-3β activity in SMB-S15 ce11s. Our data here strong1y indicate an impairment of Wnt/β-catenin pathway in prion infected ce11 1ine SMB-S15.

Prion；Wnt/β-catenin signa1ing；β-catenin；GSK-3β；Target genes

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270185，81301429，81572048）；傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金（2012SKLID102，2015SKLID503）

董小平，Emai1：dongxp238@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.002

2016-01-19）