◆姜丹 王飛 孟令軍 張洋 劉洋 劉艷 孟慶繁

深化免疫學(xué)實驗教學(xué)改革 培養(yǎng)創(chuàng)新型人才*

◆姜丹 王飛 孟令軍 張洋 劉洋 劉艷 孟慶繁

免疫學(xué)實驗是生物學(xué)實驗教學(xué)的重要組成部分，是本科生獲得免疫學(xué)知識和加深對理論知識理解的重要途徑。根據(jù)免疫學(xué)實驗教學(xué)特點，通過整合實驗教學(xué)內(nèi)容、統(tǒng)籌安排實驗時間，并以多克隆抗體制備實驗為例，改進實驗方案，使學(xué)生在實驗教學(xué)過程中多角度、多層次理解實驗原理和操作過程，在有限時間內(nèi)掌握更多的實驗技術(shù)，提高實驗成功率，從而培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、綜合分析問題解決問題的能力，以及縝密的科學(xué)思維和團隊協(xié)作意識，提高實驗教學(xué)質(zhì)量。

免疫學(xué)實驗；教學(xué)改革；實驗教學(xué)

10.3969/j.issn.1671-489X.2016.12.129

1　前言

免疫學(xué)是生命科學(xué)領(lǐng)域中重要的基礎(chǔ)課程。免疫學(xué)實驗課既是理論課程的驗證和補充，又是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、獨立思考能力、分析解決問題能力的重要手段［1］。如何使本科生通過免疫學(xué)實驗課程增加對理論知識的理解，在較短時間內(nèi)掌握更多、更前沿的免疫學(xué)實驗技術(shù)，是目前免疫學(xué)實驗教學(xué)的突出問題。

結(jié)合免疫學(xué)實驗課的教學(xué)特點，筆者經(jīng)過幾年的探索和實踐，在實驗教學(xué)中進行了一系列改革工作，優(yōu)化整合了實驗教學(xué)內(nèi)容，統(tǒng)籌安排實驗教學(xué)時間，改進實驗設(shè)計方案，使學(xué)生得到更多的獨立動手機會，提高其獨立思考分析解決問題的能力，使免疫學(xué)實驗的教學(xué)水平和效果都得到很大程度的提高。

2　整合與優(yōu)化實驗教學(xué)內(nèi)容

吉林大學(xué)國家級生物基礎(chǔ)實驗教學(xué)示范中心（以下簡稱“中心”）始終圍繞以提高人才培養(yǎng)質(zhì)量為核心，堅持“以學(xué)生為本，協(xié)調(diào)培養(yǎng)學(xué)生的知識、能力和素質(zhì)”的育人理念，根據(jù)學(xué)科的發(fā)展和社會的需要，修訂實踐教學(xué)大綱和教學(xué)內(nèi)容。對2009版實踐教學(xué)大綱中免疫學(xué)實驗的實驗項目進行調(diào)整，刪除和整合部分實驗內(nèi)容，按照抗體的制備、淋巴細胞功能檢測技術(shù)、NK細胞功能檢測技術(shù)、抗原抗體反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)、細胞因子檢測技術(shù)等6個部分重新建立實驗項目14個。適當(dāng)削減了驗證性實驗，增加了綜合性實驗，在整個免疫學(xué)實驗教學(xué)體系中既有必做實驗，又有選做實驗，使學(xué)生有更多的選擇空間。

另外，為了使本科生實驗教學(xué)的內(nèi)容與科研相通，引進2個準(zhǔn)確度和靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便、耗材低、對環(huán)境污染少的成熟的科研實驗來充實免疫學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容［2］；同時，為了提高本科生免疫學(xué)實驗操作動手能力、規(guī)范學(xué)生實驗操作的標(biāo)準(zhǔn)化，新增加1個免疫學(xué)實驗操作基本技術(shù)的培訓(xùn)實驗項目，整合后的實驗項目共16個，更注重于學(xué)生的綜合創(chuàng)新能力和實驗動手操作能力的培養(yǎng)。

3　統(tǒng)籌安排實驗時間

中心的免疫學(xué)實驗教學(xué)需要完成酶標(biāo)儀檢測技術(shù)、凝集實驗（示教）、單克隆抗體制備（示教）、多克隆抗體制備、淋巴細胞功能檢測實驗、NK細胞功能檢測實驗、設(shè)計實驗等多個實驗項目。筆者曾將每一個實驗項目分開進行，由于多克隆抗體制備實驗中免疫動物階段需要的時間較長，這樣完成整個免疫學(xué)實驗教學(xué)需要兩個多月的時間。在這個時間范圍內(nèi)就造成前松后緊的情況，往往使學(xué)生不能很好地把握實驗內(nèi)容，容易產(chǎn)生厭煩情緒，從而影響實驗效果［3］。

為了改善這種情況，統(tǒng)籌安排實驗時間，在多克隆抗體制備實驗中免疫動物的一個月時間內(nèi)，穿插進行另外幾個實驗項目的內(nèi)容，既保證每個實驗項目相對獨立地開展，又兼顧了長時間綜合性實驗的連續(xù)性和完整性。這樣在完成一個實驗項目的時間范圍內(nèi)，完成了整個免疫學(xué)的實驗教學(xué)內(nèi)容，時間從兩個多月縮短為一個多月，不僅使課程節(jié)奏相對統(tǒng)一，保障實驗教學(xué)效果，而且節(jié)省了學(xué)生和教師的時間，提高了實驗室的利用率。經(jīng)過幾年的教學(xué)實踐，得到教師和學(xué)生的廣泛認(rèn)可和好評。

4　改進實驗設(shè)計方案

在本科生免疫學(xué)實驗教學(xué)中，抗體制備是最為經(jīng)典的免疫學(xué)實驗項目之一，也是生物學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域中常用的一種實驗手段。下面以多克隆抗體制備實驗為例，介紹免疫學(xué)實驗教學(xué)方案設(shè)計和改進等方面的工作進展和經(jīng)驗。

多克隆抗體制備實驗的基本流程 多克隆抗體制備實驗的基本流程如圖1所示，使用具有較高免疫原性的雞卵清白蛋白（OVA）作為抗原，注射免疫小鼠。經(jīng)3次免疫后的小鼠血清經(jīng)過梯度稀釋后，采用間接法酶聯(lián)免疫標(biāo)記技術(shù)（ELISA）檢測，據(jù)此判定所制備的多克隆抗體的效價。

*項目來源：吉林省教育教學(xué)改革重點項目“多功能酶標(biāo)儀熒光偏振免疫分析功能的開發(fā)及應(yīng)用”（基金編號：409020720134）。作者：姜丹，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工程師，研究方向為實踐教學(xué)與管理研究；王飛、孟令軍、張洋、劉洋、劉艷，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；孟慶繁，通訊作者，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副院長兼中心常務(wù)副主任，主要從事實驗室建設(shè)與管理研究（130012）。

圖1　多克隆抗體的制備流程

小鼠免疫方法的改革 在多克隆抗體制備實驗中，小鼠需要進行3次免疫注射。小鼠的注射給藥方式有腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射等。小鼠的尾靜脈注射是科研中最常用的給藥方法，但因為操作難度較高，需要較長時間的操作訓(xùn)練才能熟練掌握，因此對于初學(xué)者成功率較低，在本科生實驗中不采用此方法。

在以前的實驗教學(xué)中選用的是小鼠肌肉注射法，這種方法在操作時需要一個人固定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的后肢，右手拿注射器，將注射器與半腱肌呈90°角迅速插入1/4，注入藥液。由于這種方式需要兩個人的配合，對于從未進行過小鼠給藥注射的初學(xué)者來說困難程度較大，尤其在完成第一次小鼠免疫的時候，常常因為手法生疏、配合不善，造成被小鼠咬傷或被注射器刺傷的情況。另外，由于小鼠體積小，肌肉層淺薄，肌肉注射也會造成小鼠不適或肌肉壞死等情況。

針對這一問題，改用小鼠頸部皮下注射免疫法，這種方法是將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環(huán)的過程。操作時，用左手抓住小鼠的頸部皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動，易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地將藥物注入皮下；拔針時左手拇、食指捏住進針部位片刻，以防止藥物外漏。這種方法操作比較簡單，而且一個人操作即可，因此在小鼠免疫的第1次和第2次注射時均采用此方法進行，成功率較高，并且被小鼠咬傷的幾率降低。

在熟練掌握了小鼠皮下注射操作的情況下，為了使學(xué)生在小鼠免疫過程中盡可能多地掌握其他的給藥注射方式，在給小鼠第3次免疫時選用腹腔注射的給藥方式。這種方法是將藥物注入胃腸道漿膜以外、腹膜以內(nèi)，由于腹膜面積大，密布血管和淋巴管，因此吸收速度較快。操作時用一只手固定小鼠，使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止刺傷腹部器官；注射器針頭以45°角插入腹中線右側(cè)，緩緩將藥液推入；注射完畢后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。這種注射方式相對簡單易行，學(xué)生在進行實驗操作過程中成功率較高，并且較為安全。

小鼠實驗組設(shè)計方案的改革 在以前的小鼠免疫過程中將小鼠分為有佐劑和無佐劑兩組，每組2只小鼠，分別注射抗原＆免疫佐劑的混合液和抗原＆生理鹽水的混合液。有佐劑組多克隆抗體制備效果較好，最終得到的多克隆抗體效價較高；而無佐劑組多克隆抗體制備效果較差，最終得到的多克隆抗體效價較低。

通過上述實驗分組，可以讓學(xué)生較好地認(rèn)識到免疫佐劑在抗體制備中的作用。然而通過多年的教學(xué)實踐，發(fā)現(xiàn)上述實驗分組方案存在兩方面弊端。

1）實驗動物浪費現(xiàn)象嚴(yán)重。一只小鼠通過摘眼球取血的方式，能夠獲得不少于100 μL的血清，而抗體效價檢測所需的血清用量是5 μL，因此，每個實驗組設(shè)置2只小鼠的作用僅僅是為了防止學(xué)生在免疫過程中由于操作不當(dāng)或飼養(yǎng)不經(jīng)心而發(fā)生的小鼠死亡。通過連續(xù)數(shù)年的教學(xué)實踐觀察，筆者發(fā)現(xiàn)在小鼠免疫過程中發(fā)生死亡的概率只有1%，即每學(xué)年50組學(xué)生總計200只小鼠的意外死亡數(shù)量平均只有2只，而為此額外設(shè)置2倍的小鼠用量是對實驗動物的嚴(yán)重浪費。

2）無佐劑組小概率出現(xiàn)高效價抗體。雖然無佐劑組制備的多克隆抗體一般情況下效價都不高，可以作為免疫佐劑功能的陰性對照，但OVA較高的免疫原性使得無佐劑組小鼠中個別個體依然會產(chǎn)生較高的抗體效價，對ELISA實驗的抗體效價數(shù)據(jù)假陽性產(chǎn)生質(zhì)疑，使學(xué)生對理論知識的理解造成一定的混淆。

針對上述實驗方案的缺陷，對原有的小鼠實驗組設(shè)置方式進行優(yōu)化，如表1所示。將實驗小鼠分為有佐劑組、無佐劑組和無抗原組，每組1只小鼠。有佐劑組注射免疫佐劑和抗原的混合液，無佐劑組注射抗原的生理鹽水溶液，無抗原組只注射等量的生理鹽水。同時在實驗課進行過程中，由助教按照標(biāo)準(zhǔn)流程與學(xué)生平行進行一組示范實驗，所得的小鼠血清作為標(biāo)準(zhǔn)樣本備用。新的小鼠實驗組設(shè)置有效地解決了實驗小鼠的浪費現(xiàn)象和陰性對照組不全的問題，在發(fā)生小鼠意外死亡的小概率事件時，任課教師會在ELISA實驗時為該組提供相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)血清使其順利完成ELISA實驗。另外，無抗原組作為抗原的陰性對照組是不會出現(xiàn)任何抗體效價信號的，在無佐劑組出現(xiàn)小概率高效價信號時能夠起到很好的對照和參考作用。

表1　免疫小鼠實驗組

5　結(jié)語

針對免疫學(xué)實驗教學(xué)中存在的問題，對實驗教學(xué)內(nèi)容的設(shè)置、實驗教學(xué)時間的統(tǒng)籌安排、實驗設(shè)計方案的改進進行一系列的改革和探索，使免疫學(xué)實驗教學(xué)質(zhì)量有了大幅度的提高。同時，學(xué)生的實驗興趣與科研能力顯著提升，由被動學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾餍詫W(xué)習(xí)、合作性學(xué)習(xí)和研究性學(xué)習(xí)。在此基礎(chǔ)上要不斷完善，使實驗教學(xué)水平更上一個新的臺階，為發(fā)展學(xué)生創(chuàng)新思維能力，進一步獲取和創(chuàng)造新知識打下基礎(chǔ)［4-5］?！?/p>

［1］王敏，包常華.提高醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗教學(xué)質(zhì)量的探索與體會［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2014，16（11）：938-939.

［2］蘇小平，王全興.本科生免疫學(xué)實驗教學(xué)改革實踐［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2014，16（8）：612-622.

［3］任可，陳建芳，常江，等.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗教學(xué)改革初探［J］.中國免疫學(xué)雜志，2014（30）：1259-1260.

［4］潘清.創(chuàng)新實驗教學(xué)探索［J］.實驗技術(shù)與管理，2010，27（8）：24-26.

［5］由繼紅.實驗室與創(chuàng)新教育研究［J］.實驗技術(shù)與管理，2010，27（9）：16-17.

G642.0

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1671-489X（2016）12-0129-03