江晨舟 孫潔敏 張馳中 邵明華 / 上海安譜實驗科技股份有限公司

食品中蘇丹紅檢測方法的比較和優(yōu)化

江晨舟 孫潔敏 張馳中 邵明華 / 上海安譜實驗科技股份有限公司

采用GB 19681-2005規(guī)定的高效液相色譜法（HPLC）對食品中的蘇丹紅含量進行檢測，并對該方法進行前處理條件和色譜條件的優(yōu)化。實驗研究結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化的方法專用SPE小柱有較好的回收率，SPE過程簡單直觀，易于操作，色譜分析條件簡單快速，流動相易于配制，回收率穩(wěn)定在95.0%～98.0%，優(yōu)于高效液相色譜法的回收率80%～90%，因此更適合于食品中蘇丹紅含量的檢測。

HPLC；蘇丹紅；食品；光學誘導異構(gòu)

0　引言

蘇丹紅是一類人工合成的親脂性、偶氮類染料，主要包括蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 四種類型，見圖1。

蘇丹紅染料是分子結(jié)構(gòu)中含有偶氮基（一N=N一）發(fā)色團的一類人工合成的脂溶性偶氮染料，主要用于紡織品、橡膠、塑料、油漆等的著色劑［1］。蘇丹紅具有潛在的致癌性、遺傳毒性及致敏性，這與其胺類、萘酚類代謝產(chǎn)物有關(guān)［2］。研究表明，蘇丹紅染料分子可以通過多種途徑接觸到人體，并透過生物膜通過血液循環(huán)分散到全身各組織細胞，與生物體內(nèi)的大分子（蛋白質(zhì)、DNA等）相結(jié)合，生成致敏、致癌物質(zhì)。因此，一些國家和機構(gòu)相繼頒布了法律法規(guī)和技術(shù)標準，嚴令禁止蘇丹紅染料作為食品添加劑應用于食品生產(chǎn)中。世界癌癥研究機構(gòu)（IARC）將其列為第三類可能致癌物質(zhì)［3-4］。

目前，檢測這四種蘇丹紅染料的方法主要有分光光度法［5］、薄層色譜法［6］、電化學法［7］、酶聯(lián)免疫法［8］、液相色譜法［9］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-14］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［15-20］和毛細管電泳法［21］等。這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量存在差異。氣相色譜-質(zhì)譜法儀器設(shè)備較昂貴，并且對操作人員的技術(shù)水平要求較高，難以普及。高效液相色譜儀器價格相對便宜，操作簡單，一般檢測機構(gòu)都已普及。國家標準GB/T 19681-2005［22］規(guī)定了食品中蘇丹紅染料的高效液相色譜測定方法（以下簡稱國標法），但在實驗過程中，檢測到蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ分別有兩個色譜峰，經(jīng)分析是蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的光學誘導異構(gòu)體，而在國標法中并未提及。本實驗在重復國標法的基礎(chǔ)上對其進行優(yōu)化，采用蘇丹紅專用固相萃取柱凈化樣品，利用物理避光法準確測定不同基質(zhì)中的蘇丹紅。本實驗方法簡稱安譜法。

圖1　蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)

1　材料與方法

1.1試劑與標準品

國標法耗材：乙腈、水、正己烷、丙酮、乙醚、甲酸、無水硫酸鈉、氧化鋁層析柱、5%丙酮-正己烷溶液、蘇丹紅Ⅰ標準品、蘇丹紅Ⅱ標準品、蘇丹紅Ⅲ標準品、蘇丹紅Ⅳ標準品。

安譜法：乙腈、水、正己烷、丙酮、蘇丹紅Ⅰ標準品、蘇丹紅Ⅱ標準品、蘇丹紅Ⅲ標準品、蘇丹紅Ⅳ標準品、0.45 μm有機濾膜。

1.2儀器與設(shè)備

實驗用儀器與設(shè)備見表1、表2。

表1　國標法儀器列表

表2　安譜法儀器列表

1.3色譜條件

1.3.1 國標法色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18 4.6 mm×150 mm，3.5 μm（或相當型號色譜柱）；

流動相：溶劑A 0.1%甲酸的水溶液∶乙腈=85∶15；溶劑B 0.1%甲酸的乙腈溶液∶丙酮=80∶20；

流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：蘇丹紅Ⅰ 478 nm；蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ520 nm；于蘇丹紅I出峰后切換。進樣量10 μL。

1.3.2 安譜法色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18-WP 4.6 mm×150 mm，5 μm；

流動相：乙腈∶水= 88∶12；

流速：1 mL/min；

紫外波長：500 nm；

柱溫：35 ℃；

進樣量：20 μL。

1.4標準曲線的配制

1.4.1 國標法

標準儲備液：分別稱取蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ及蘇丹紅Ⅳ各10.0 mg（按實際含量折算），用乙醚溶解后再用正己烷定容至250 mL。

標準溶液的配制：吸取標準儲備液（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6） mL，用正己烷定容至25 mL。此標準溶液的濃度分別為（0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56） μg/mL，繪制標準曲線。

1.4.2 安譜法

標準儲備液：分別稱取蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ及蘇丹紅Ⅳ各10.0 mg，用丙酮溶解后用乙腈定容至20 mL，制成500 mg/L的溶液，再稀釋至50 mg/L的標準儲備液。

標準溶液的配制：吸取標準儲備液（0.02、0.1、0.2、1.0、4.0） mL，用乙腈定容至10 mL。此標準溶液的濃度分別為（0.1、0.5、1.0、5.0、20.0） mg/L。

1.5樣品處理

1.5.1 國標法

1.5.1.1 紅辣椒粉等粉狀樣品

稱取1 g樣品于三角瓶中，加入10 mL正己烷，超聲5 min，過濾，用10 mL正己烷洗滌殘渣數(shù)次，至洗出液無色，合并正己烷液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL以下，慢慢加入到氧化鋁層析柱中。為保證層析效果，在柱中保持正己烷液面為2 mm左右時上樣。在全程的層析過程中不應使柱干涸。用正己烷少量多次淋洗濃縮瓶，一并注入層析柱?？刂蒲趸X表層吸附的色素帶寬小于0.5 cm。待樣液完全流出后，視樣品中含油類雜質(zhì)的多少用10 mL正己烷洗柱，直至流出液無色。棄去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脫，收集、濃縮后，用丙酮轉(zhuǎn)移并定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后待測。

1.5.1.2 紅辣椒油、火鍋料、奶油等油狀樣品

稱取0.5 g（準確至0.001 g）樣品于小燒杯中，加入5 mL正己烷溶解。難溶解的樣品可于正己烷中加溫溶解。按1.5.1.1中“慢慢加入到氧化鋁層析柱……過濾后待測”操作。

1.5.1.3 辣椒醬、番茄沙司等含水量較大的樣品

稱取10 g（準確至0.01 g）樣品于離心管中，加10 mL水將其分散成糊狀，含增稠劑的樣品多加水。加入30 mL正己烷∶丙酮 = 3∶1，勻漿5 min，3 000 r/min離心10 min， 吸出正己烷層。于下層再加入20 mL×2次正己烷勻漿，離心，合并3次正己烷，加入無水硫酸鈉5 g脫水。過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干并保持5 min，用5 mL正己烷溶解殘渣后，按1.5.1.1中“慢慢加入到氧化鋁層析柱……過濾后待測”操作。

1.5.1.4 香腸等肉制品

稱取粉碎樣品10 g（準確至0.01 g）于三角瓶中，加入60 mL正己烷充分勻漿5 min，濾出清液，再以20 mL×2次正己烷勻漿，過濾。合并3次濾液，加入5 g無水硫酸鈉脫水。過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸至5 mL以下，按1.5.1.1中“慢慢加入到氧化鋁層析柱中……過濾后待測”操作。

1.5.2 安譜法

1.5.2.1 粉狀樣品

實驗室選取市售辣椒粉為代表樣品，稱取1 g樣品（準確至0.001 g）于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，旋渦混合30 s，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個50 mL離心管中。10 mL正己烷溶解殘渣同樣操作一次。合并正己烷液，用氮吹儀濃縮至5 mL以下，等待SPE上樣。

1.5.2.2 油狀樣品

實驗室選取市售辣椒油、食用油、火鍋調(diào)料為代表樣品，稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，旋渦混合30 s，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液等待SPE上樣。

1.5.2.3 含水量較多的樣品

實驗室選取市售辣椒醬、方便面醬包、番茄沙司、腐乳為代表樣品，稱取5 g（準確至0.01 g），加入5 mL水將其分散成糊狀。再加入10 mL正己烷∶丙酮= 3∶1，旋渦混合5 min，超聲5 min， 4 000 r/min離心10 min，吸出正己烷層。10 mL正己烷溶解殘渣同樣操作一次。合并正己烷液，加入5 g無水硫酸鈉，用氮吹儀濃縮至干，用5 mL正己烷溶解后等待SPE上樣。

1.5.2.4 固態(tài)制品

實驗室選取香腸、豆豉、禽蛋作為代表樣品，經(jīng)粉碎機處理后稱取粉碎樣品1 g（準確至0.01 g）于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，旋渦混合30 s，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個50 mL離心管中。10 mL正己烷溶解殘渣同樣操作一次。合并正己烷液，加入5 g無水硫酸鈉，用氮吹儀濃縮至干，用5 mL正己烷溶解后等待SPE上樣。

1.6SPE方法

1.6.1 國標法

活化平衡：10 mL正己烷；

上樣：5 mL上樣；

淋洗：10 mL至流出液無色；

洗脫：5%丙酮正己烷60 mL；

濃縮定容：濃縮定容至5 mL，過0.45 μm有機濾膜。

1.6.2 安譜法

活化：5 mL二氯甲烷；

平衡：5 mL正己烷；

上樣：取5 mL上樣，2 mL正己烷潤洗；

淋洗：5 mL正己烷；

洗脫：5 mL二氯甲烷；

濃縮定容：40 ℃氮吹近干，1 mL 0.8%氨水乙腈，過0.22 μm親水PTFE針式濾器。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜圖比較

由圖2和圖4比較可看出，安譜法的色譜圖中沒有出現(xiàn)國標法色譜圖中蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的兩個色譜峰現(xiàn)象。由圖3與圖5比較可看出，以辣椒油為基質(zhì)時，安譜法測得的峰面值比國標法高，這是由于國標法中的氧化鋁活性不好控制，吸附或洗脫不完全時可能會有一些殘留。

2.2樣品回收率

按照上述基質(zhì)分類的方法進行樣品處理，樣品加標濃度均為1 μg/mL。根據(jù)標準曲線色譜圖，1 μg/mL標準的峰面積為蘇丹紅Ⅰ：0.610 0 mAU ·min；蘇丹紅Ⅱ：0.619 9 mAU·min；蘇丹紅Ⅲ：0.873 9 mAU·min；蘇丹紅Ⅳ：0.749 3 mAU·min。具體樣品處理情況見表3～表10。

圖2　國標法蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ1×10-6光照色譜

圖3　國標法辣椒粉蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ1×10-6色譜

圖4　安譜法蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ1×10-6光照色譜

圖5　安譜法辣椒油中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ色譜

表3～表10提供了國標法和安譜法對這四種蘇丹紅染料各種基質(zhì)的處理情況。結(jié)果表明，采用CNW 蘇丹紅專用SPE小柱和基質(zhì)處理的優(yōu)化方案之后，安譜法的回收率穩(wěn)定在95.0%～98.0%之間，而國標法的回收率穩(wěn)定在80%～90%之間，因此安譜法在回收率方面優(yōu)于國標法。

表3　國標法蘇丹紅Ⅰ

表4　安譜法蘇丹紅Ⅰ

表5　國標法蘇丹紅Ⅱ

由表7～表10可看到，辣椒醬中檢測到了蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ。為了判斷其性質(zhì)，將其與蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的標準光譜圖對比，結(jié)果如圖6所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，辣椒醬中的疑似峰與蘇丹紅標準的色譜峰不一致，所以并非蘇丹紅，而是雜質(zhì)峰。

表6　安譜法蘇丹紅Ⅱ

表7　國標法蘇丹紅Ⅲ

表8　安譜法蘇丹紅Ⅲ

表9　國標法蘇丹紅Ⅳ

表10　安譜法蘇丹Ⅳ紅

2.3標準曲線及相關(guān)系數(shù)

國標法在0.16～2.56 μg/mL內(nèi)以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標作標準曲線，線性方程如表11所示。

表11　國標法蘇丹紅標準曲線

圖6　辣椒醬光譜與蘇丹紅標準光譜對比

表12　安譜法蘇丹紅標準曲線

安譜法在0.10～20.00 mg/L內(nèi)以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標作標準曲線，線性方程如表12所示。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積形成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，其中安譜法檢測樣品的最低濃度比國標法低，測定的相關(guān)系數(shù)比國標法高，線性關(guān)系更好。

3　結(jié)語

在蘇丹紅標準品混合物的檢測中，對GB/T 19681-2005國家標準中規(guī)定的高效液相色譜檢測方法進行重復試驗，在優(yōu)化前處理方法和色譜條件后分別進行對比分析。從實驗中可以發(fā)現(xiàn)：

1）安譜法專用SPE小柱，SPE過程簡單直觀，易于操作。而國標法采用氧化鋁層析柱，過程復雜，操作繁瑣，活性不穩(wěn)定。

2）安譜法配合反相色譜柱，選擇適量丙酮+乙腈作定容溶劑，而國標法采用正己烷作定容溶劑。正己烷是正相的，根據(jù)相似相容原理，會對反相色譜柱造成一定影響。

3）安譜法色譜分析條件簡單快速，流動相易于配制，并把國標法繁瑣的梯度條件改為恒定條件，選擇更合適的波長，檢測目標物質(zhì)出峰良好。

4）安譜法分析研究了光學異構(gòu)現(xiàn)象，精確分析定量，提高了檢測準確度。而國標法忽略了光學異構(gòu)現(xiàn)象，準確度低。

5）國標法由于填料活度控制和大體積洗脫液濃縮帶來不確定因素。安譜法改進了國標法，提高了分析精密度。

6）安譜法檢測限和國標法保持一致。

綜上所述，安譜法在國標法的基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化和改進，更適合于食品中蘇丹紅含量的檢測。

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計量動態(tài)

上海市計量測試技術(shù)研究院第四屆科技節(jié)拉開帷幕

2016年5月19日，上海市計量測試技術(shù)研究院第四屆科技節(jié)以“聚焦計量科技，助力科創(chuàng)中心”為主題，正式拉開帷幕。上海交通大學常務副校長林忠欽院士、上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局總工程師陸敏等應邀出席活動。

會上，林忠欽以“提升中國制造業(yè)質(zhì)量與品牌戰(zhàn)略”為題作主題報告，重點闡述了我國實施制造強國戰(zhàn)略的意義、制造業(yè)質(zhì)量的現(xiàn)狀和發(fā)展目標、發(fā)達國家工業(yè)質(zhì)量發(fā)展經(jīng)驗以及我國制造業(yè)質(zhì)量品牌提升三年行動計劃等內(nèi)容。

陸敏對上海市計量測試技術(shù)研究院第四屆科技節(jié)開幕表示熱烈祝賀，并指出，上海市計量測試技術(shù)研究院多年來秉持和發(fā)揚“善于思考、勇于創(chuàng)新、敢于擔當”的科研精神，緊密圍繞計量檢測新技術(shù)和新領(lǐng)域，依托優(yōu)勢研究方向，積極組建科技創(chuàng)新團隊，在“十二五”期間共獲省部級以上獎項21項，其中上海市科技進步獎二等獎5項，取得了出色的成績。他希望上海市計量測試技術(shù)研究院以增強計量科技創(chuàng)新能力、積極探索落實科技成果轉(zhuǎn)化為己任，抓住改革創(chuàng)新先機，勇于探索、精準發(fā)力，推進上?？苿?chuàng)中心建設(shè)。

會議宣讀了上海市計量測試技術(shù)研究院獲得2015年度上海市科技進步獎、國家質(zhì)檢總局科技興檢獎等多個獎項的獲獎名單，并對獲獎者進行了表彰。

上海市計量測試技術(shù)研究院科技節(jié)活動至今已舉辦至第四屆，繼主題報告暨頒獎儀式后還將舉辦科技創(chuàng)新論壇、服務中小企業(yè)標準化講座、科技創(chuàng)新成果展、跨世紀宣傳等系列活動。

（本刊通訊員）

Comparison and optimization of detection methods for sudan red in foods

Jiang Chenzhou， Sun Jiemin， Zhang Chizhong，Shao Minghua
（ANPEL Scientifc Instrument （Shanghai） Co.，Ltd.）

The high performance liquid chromatography（HPLC） stipulated in GB 19681-2005 was adopted to detect sudan red in foods. The detection method was optimized in pre-treatment conditions and chromatographic conditions. Compared with the HPLC， the experimental results showed that the dedicated SPE cartridges had good recovery， SPE process was simple and intuitive， easy to operate， chromatographic conditions were simple and rapid， the mobile phase was easy to prepare， the recoveries was 95.0%-98.0%， which was superior to the recovery of HPLC 80%-90%， so the optimized detection method is more suitable for detecting sudan red in foods.

HPLC； sudan red； food； optically induced isomerization