劉顯波　謝黎虹　唐紹清　凃巨民　胡培松　羅炬（中國(guó)水稻研究所，杭州30006；浙江大學(xué)，杭州30000；通訊作者：luojurice@6.com）

水稻抗二化螟特性鑒定技術(shù)的評(píng)價(jià)研究

劉顯波1謝黎虹1唐紹清1凃巨民2胡培松1羅炬1*
（1中國(guó)水稻研究所，杭州310006；2浙江大學(xué)，杭州310000；*通訊作者：luojurice@126.com）

采用離體葉片、離體莖稈、離體剝開莖稈及活體成株4種室內(nèi)抗蟲性鑒定方法，對(duì)相同水稻材料進(jìn)行抗二化螟特性鑒定，同時(shí)對(duì)這些水稻室內(nèi)抗二化螟鑒定技術(shù)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，這些方法的抗性鑒定結(jié)果高度吻合，離體葉片鑒定方法是目前最快速、有效的抗二化螟鑒定方法。并通過離體葉片和活體成株鑒定方法對(duì)轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料進(jìn)行鑒定，再次驗(yàn)證了離體葉片鑒定方法的有效性。此外，初步發(fā)現(xiàn)對(duì)于同為鱗翅目水稻害蟲稻縱卷葉螟，用離體葉片鑒定方法也可進(jìn)行有效鑒定。

水稻；二化螟；抗性鑒定；技術(shù)評(píng)價(jià)

水稻是我國(guó)主要的糧食作物，近20年水稻播種面積占全國(guó)糧食播種面積的比例一直穩(wěn)定在27%～28%，水稻總產(chǎn)占全國(guó)糧食總產(chǎn)的1/3以上（數(shù)據(jù)來源于中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局，http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj），超過一半以上的人口以稻米為主食，水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)糧食安全至關(guān)重要。稻飛虱、二化螟和稻縱卷葉螟是我國(guó)水稻生產(chǎn)中最主要的害蟲，常年給水稻造成巨大的產(chǎn)量損失，2001-2004年間全國(guó)水稻病蟲害發(fā)生面積超過850萬hm2次，其中，2003年稻飛虱、稻縱卷葉螟、水稻螟蟲發(fā)生面積占病蟲害總發(fā)生面積的72.5%［1］。據(jù)全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)，自2003年大爆發(fā)以來稻縱卷葉螟年發(fā)生2 000萬hm2次以上，自2000年來螟蟲的危害維持在2 000萬hm2次左右。農(nóng)藥的大量使用造成了環(huán)境污染、生產(chǎn)成本增加。因此，培育抗蟲（稻飛虱、二化螟和稻縱卷葉螟等）水稻新品種并應(yīng)用于生產(chǎn)是解決上述問題最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。而建立水稻材料抗蟲性的有效鑒定體系是進(jìn)行抗蟲育種的根本基礎(chǔ)。

二化螟Chilosuppressalis（Walker）屬于鉆蛀性害蟲，在水稻分蘗期危害造成枯鞘、枯心苗，在穗期危害造成傷株和白穗，系水稻3個(gè)主要害蟲之一；然而對(duì)水稻抗二化螟特性的高效準(zhǔn)確鑒定難度大，其原因主要有：幼蟲容易轉(zhuǎn)株為害、試驗(yàn)中易發(fā)生逃逸；接蟲時(shí)二化螟的活性強(qiáng)弱、受鑒水稻材料的發(fā)育階段以及環(huán)境條件如溫度、濕度等諸多因素影響，試驗(yàn)條件難以保證高度一致；鑒定操作流程多且復(fù)雜，易出現(xiàn)偏差。早在1985年國(guó)際水稻研究所提出了活體成株抗蟲鑒定方法和抗級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［2］；2000年葉恭銀等提出利用離體葉片用于轉(zhuǎn)蘇云金桿菌毒蛋白基因水稻的二化螟鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，鑒定結(jié)果與活體成株鑒定法所取得的結(jié)果相吻合［3］；2002年姚青等發(fā)明了離體稻株抗二化螟鑒定技術(shù)，該方法可靠而且準(zhǔn)確［4］。2010年四川省制定“水稻抗二化螟鑒定技術(shù)規(guī)程”地方標(biāo)準(zhǔn)（DB51），包括田間鑒定和離體莖稈鑒定方法［5］，這些鑒定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。由于是不同的研究者利用不同的材料在不同的時(shí)期用不同的方法進(jìn)行室內(nèi)抗蟲性鑒定，鑒定方法和鑒定結(jié)果的有效性需要進(jìn)一步明確［6］。鑒于此，筆者利用同一批水稻材料，采用離體葉片、離體莖稈、離體剝開莖稈及活體成株等多種室內(nèi)抗蟲性鑒定方法進(jìn)行抗蟲性鑒定比較，以期對(duì)這些水稻室內(nèi)抗二化螟鑒定技術(shù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為有效鑒定和評(píng)價(jià)水稻抗二化螟能力提供技術(shù)支撐。同時(shí)，選擇綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)方法對(duì)同為鱗翅目水稻害蟲稻縱卷葉螟進(jìn)行抗蟲性鑒定，以期找到一種方便快捷的稻縱卷葉螟抗蟲性鑒定方法。

1　材料與方法

1.1供試蟲準(zhǔn)備

供試驗(yàn)用二化螟卵塊購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。將購買的卵塊置于培養(yǎng)皿中，保持一定的溫度（25℃～28℃）和濕度（RH 80%～90%），直至孵化，取剛剛孵化的幼蟲供正式試驗(yàn)用。稻縱卷葉螟幼蟲及蟲卵在中國(guó)水稻研究所富陽實(shí)驗(yàn)基地試驗(yàn)田內(nèi)采集。

1.2供試水稻材料

供試水稻材料包括臺(tái)中在來1號(hào)（簡(jiǎn)稱TN 1，感蟲對(duì)照）、轉(zhuǎn)cry1Ab/1Ac基因水稻華恢1號(hào)（抗蟲對(duì)照）及其非轉(zhuǎn)基因受體材料明恢63、轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻及其非轉(zhuǎn)基因受體材料日本晴。

1.3試驗(yàn)地點(diǎn)及種植方式

試驗(yàn)在中國(guó)水稻研究所富陽轉(zhuǎn)基因中試基地進(jìn)行，供試水稻材料5月25日播種，單本分別移栽至大田和塑料桶中，大田每個(gè)材料種植4行8株，每個(gè)材料種植25個(gè)塑料桶。整個(gè)生育期間不施任何殺蟲劑。

1.4華恢1號(hào)陽性株鑒定

取華恢1號(hào)水稻葉片放置于1.5 mL離心管中研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋，將Cry1Ab/1Ac膠體金免疫檢測(cè)試紙條（美國(guó)一龍公司）插入樣品液，5min后觀察結(jié)果。在試紙條上出現(xiàn)1條檢測(cè)線和1條質(zhì)控線為陽性（含毒蛋白），記為“+”；僅出現(xiàn)1條質(zhì)控線為陰性（無毒蛋白），記為“-”。

1.5抗螟性鑒定方法

1.5.1離體葉片法

參考農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè)抗蟲水稻抗蟲性鑒定標(biāo)準(zhǔn)》（農(nóng)業(yè)部953公告-8.1-2007）中的方法，在水稻分蘗中期，分別從各供試材料的單本種植的稻株中，隨機(jī)從3個(gè)分蘗上剪取3～4 cm長(zhǎng)的葉片（倒1葉）各1片。隨后在葉片兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片，將葉片移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）內(nèi)徑，然后每管分別接入12頭蟻螟（二化螟或稻縱卷葉螟），管口塞緊脫脂棉花。第4天向管內(nèi)添加新鮮供試葉片2～3片，自開始接蟲后第7天檢查葉片，記錄幼蟲存活數(shù)，對(duì)每個(gè)玻璃管的活蟲體質(zhì)量進(jìn)行稱量。每個(gè)株系鑒定10株，2次重復(fù)。

根據(jù)試蟲存活情況，計(jì)算各供試材料每個(gè)株系的試蟲死亡率，并參照感蟲對(duì)照的平均試蟲死亡率計(jì)算試蟲校正死亡率和平均校正死亡率，根據(jù)校正死亡率劃分抗、感等級(jí)，評(píng)價(jià)供試材料的抗二化螟或稻縱卷葉螟特性。校正死亡率=（供試材料試蟲死亡率-感蟲對(duì)照試蟲平均死亡率）/（1-感蟲對(duì)照試蟲平均死亡率）× 100。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：

級(jí)別抗性幼蟲校正死亡率

0級(jí)HR（高抗）>80%

1級(jí)R（抗）60.1%～80%

3級(jí)MR（中抗）40.1%～60%

5級(jí)MS（中感）20.1%～40%

7級(jí)S（感）＜20%

9級(jí)HS（高感）全部死亡

1.5.2離體莖稈法

取分蘗盛期的主分蘗稻苗2根，把稻苗擦干，將2根稻苗截取成包含葉鞘的5 cm莖稈2根，隨后在莖稈兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片。然后每根莖稈分別接入6頭二化螟蟻螟，將2根莖稈移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）內(nèi)徑，管口塞緊脫脂棉花。接蟲后第7天分別考查或測(cè)定幼蟲死亡率和活蟲體質(zhì)量。其間，于第3天在莖稈兩端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片確保莖稈濕潤(rùn)。每個(gè)株系鑒定5株，2次重復(fù)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)同離體葉片法。

1.5.3離體剝開莖稈法

取分蘗盛期的主分蘗稻苗2根，把稻苗擦干，將2根稻苗截取成包含葉鞘的5 cm莖稈2根，將莖稈剝開，用細(xì)毛筆輕輕將12頭二化螟蟻螟接種在剝開的莖稈中（每個(gè)莖稈接蟲6頭），隨后在莖稈兩端壓上用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片，將莖稈移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）內(nèi)徑，管口塞緊脫脂棉花。接蟲后第7天分別考查或測(cè)定幼蟲死亡率和活蟲體質(zhì)量。其間，于第3天在莖稈兩端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鮮液浸漬過的小濾紙片確保莖稈保濕。每個(gè)株系鑒定5株，2次重復(fù)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)同離體葉片法。

1.5.4活體成株抗蟲性鑒定法

參照國(guó)際水稻研究所抗蟲鑒定方法，將種植在塑料桶中且?guī)?～3個(gè)分蘗的稻株搬至溫室，用細(xì)毛筆輕輕將二化螟蟻螟接種在夾于莖稈與葉鞘之間的葉舌處，每株接10頭，并加塑料網(wǎng)罩（直徑20 cm，高70 cm）。接蟲后2周移去網(wǎng)罩。接蟲后15 d、30 d考查各稻株中有無枯心，調(diào)查枯心率和枯心指數(shù)。每個(gè)株系鑒定10株，2次重復(fù)?？菪穆剩?）=單株枯心數(shù)/單株分蘗數(shù)。參照Heinrichs［2］溫室鑒定二化螟抗性按枯心指數(shù)進(jìn)行分級(jí)評(píng)定?？剐詷?biāo)準(zhǔn)：

級(jí)別抗性枯心指數(shù)

0級(jí)HR（高抗）無害

1級(jí)R（抗）＜20%

3級(jí)MR（中抗）20.1%～40%

5級(jí)MS（中感）40.1%～60%

7級(jí)S（感）60.1%～80%

9級(jí)HS（高感）>80%

2　結(jié)果與分析

2.1華恢1號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性檢測(cè)

在移栽至大田和塑料桶1周后，對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)所有的單株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性檢測(cè)，剔除陰性單株，防止陰性單株與陽性單株抗蟲性差異造成的試驗(yàn)誤差。選取陽性單株進(jìn)行抗蟲性鑒定，結(jié)果見圖1。

2.24種室內(nèi)抗蟲鑒定方法的吻合性比較

表1　利用離體葉片、離體莖稈和離體剝離莖稈法對(duì)水稻材料抗二化螟特性評(píng)價(jià)結(jié)果

表2　利用活體成株鑒定法對(duì)水稻材料進(jìn)行二化螟抗性評(píng)價(jià)結(jié)果

表3　利用離體葉片鑒定法對(duì)水稻材料抗稻縱卷葉螟特性評(píng)價(jià)結(jié)果

圖1　華恢1號(hào)的Cry1Ab/1Ac蛋白檢測(cè)結(jié)果

分別利用離體葉片、離體莖稈、離體剝開莖稈鑒定技術(shù)對(duì)感蟲對(duì)照TN1、抗蟲對(duì)照華恢1號(hào)及常規(guī)稻明恢63等3份水稻材料進(jìn)行抗二化螟特性鑒定，結(jié)果如表1。從表1可以看出，感蟲對(duì)照TN1各重復(fù)均表現(xiàn)為不抗二化螟，表現(xiàn)穩(wěn)定；以TN1作為參照，抗蟲對(duì)照華恢1號(hào)的校正死亡率為100%，表現(xiàn)為高抗二化螟；而常規(guī)稻明恢63 3種鑒定方法的平均校正死亡率在3.44%～13.56%之間，表現(xiàn)為感二化螟，方差分析表明，3種鑒定方法結(jié)果無顯著差異。利用活體成株鑒定方法對(duì)同樣3個(gè)品種進(jìn)行二化螟抗性評(píng)估，結(jié)果見表2。從表2可見，TN1枯心率達(dá)100%，華恢1號(hào)未發(fā)現(xiàn)枯心，分別表現(xiàn)為高感和高抗二化螟，與離體葉片法、離體莖稈法、離體剝開莖稈法鑒定結(jié)果相吻合；常規(guī)稻明恢63接蟲后第15天和第30天的枯心率分別為62.5%和72.5%，表現(xiàn)為感二化螟，與上述3種鑒定方法的結(jié)果相同。總體而言，4種鑒定方法均適宜用于水稻抗二化螟特性的評(píng)價(jià)，鑒定結(jié)果無明顯差異。

2.3對(duì)稻縱卷葉螟的抗性評(píng)價(jià)

利用離體葉片鑒定方法對(duì)感蟲對(duì)照TN1、抗蟲對(duì)照華恢1號(hào)及常規(guī)稻明恢63等3份水稻材料進(jìn)行抗稻縱卷葉螟特性鑒定，結(jié)果與抗二化螟特性鑒定結(jié)果一致，以TN1作為參照，抗蟲對(duì)照華恢1號(hào)的評(píng)價(jià)校正死亡率為100%，表現(xiàn)為高抗稻縱卷葉螟，而常規(guī)稻明恢63平均校正死亡率為3.85%，表現(xiàn)為感稻縱卷葉螟（表3）。因此，對(duì)轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可利用離體葉片鑒定方法進(jìn)行鑒定。

2.4轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料抗蟲性檢測(cè)

利用離體葉片鑒定法和活體成株鑒定法對(duì)轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料進(jìn)行抗二化螟特性鑒定，除感蟲對(duì)照品種TN1外，轉(zhuǎn)Vip3A基因水稻材料和對(duì)照日本晴在接蟲30 d后的枯心率均略高于接蟲15 d的枯心率（表4），表明接蟲15 d后二化螟的危害在繼續(xù)擴(kuò)展。因此，抗二化螟的特性分析以接蟲30 d的枯心率結(jié)果為準(zhǔn)，其中，明恢63在接蟲15 d和30 d的枯心率的差異也有相同反應(yīng)（表2）。2種鑒定方法鑒定結(jié)果表明，13GV-12、13GV-18、13GV-30表現(xiàn)為高抗二化螟，抗二化螟能力均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N日本晴，GV-2、GV-38、GV-48、GV-54、GV-63、GV-81表現(xiàn)為感或中感二化螟，與對(duì)照日本晴抗二化螟能力相仿，再次驗(yàn)證離體葉片鑒定方法與活體成株鑒定方法的研究結(jié)果相一致。

表4　利用離體葉片鑒定法和活體成株鑒定法對(duì)轉(zhuǎn)Vip3A水稻材料抗二化螟特性評(píng)價(jià)結(jié)果

3　小結(jié)與討論

目前常用的抗蟲性鑒定方法主要包括田間抗蟲性鑒定和室內(nèi)抗蟲性鑒定。田間抗蟲性鑒定是在自然條件下進(jìn)行，方法簡(jiǎn)便，真實(shí)感強(qiáng)，但易受田塊中蟲口密度不均勻、被檢測(cè)群體大小（及重復(fù)數(shù)）、氣候條件（如溫度、濕度等）甚至鳥獸危害等多方面因素影響，鑒定結(jié)果容易出現(xiàn)偏差。室內(nèi)抗蟲性鑒定環(huán)境可以控制或保護(hù)，采取人工接蟲，方法易規(guī)范，結(jié)果可比性強(qiáng)、重復(fù)性好，但對(duì)于離體材料（葉、莖稈等）存在保鮮、供試蟲齡、適宜的被檢測(cè)群體、后期剝檢查蟲工作量大等問題，相對(duì)于室外抗蟲性鑒定，離體抗蟲性鑒定的檢測(cè)成本較高，過程較煩瑣，這種方法適宜有條件的單位在需對(duì)水稻材料抗蟲性準(zhǔn)確鑒定的情況下使用。研究結(jié)果表明，對(duì)水稻抗二化螟特性鑒定采取離體葉片法、離體莖稈法、離體剝開莖稈法鑒定與活體成株法鑒定的結(jié)果完全吻合。離體葉片鑒定法具有快速、簡(jiǎn)便、不損傷稻株、后期容易剝檢查蟲的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于離體莖稈鑒定剝開與否，試驗(yàn)證明對(duì)二化螟的存活和生長(zhǎng)無明顯差異，但對(duì)鑒定后期剝檢查蟲而言，離體剝開莖稈鑒定法更容易造成二化螟鉆入莖稈內(nèi)鞘內(nèi)部，由于為害后期莖稈顏色與幼蟲體色相近，容易漏檢蟲數(shù)，從而造成數(shù)據(jù)偏差，而離體莖稈中的幼蟲主要存在于莖稈內(nèi)鞘?？傮w而言，離體葉片鑒定法是目前最快速、有效的抗二化螟鑒定方法。另外，離體鑒定法中供試蟲齡，以剛剛孵化6 h以內(nèi)的蟻螟為宜。運(yùn)用離體葉片鑒定法測(cè)定水稻抗稻縱卷葉螟和抗二化螟的結(jié)果一致，對(duì)轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可以利用離體葉片鑒定法進(jìn)行鑒定。由于稻縱卷葉螟和二化螟同屬于鱗翅目害蟲，且對(duì)Bt蛋白更加敏感，初步判斷對(duì)于轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的稻縱卷葉螟抗性鑒定可以參照其二化螟抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，結(jié)論是否成立可以通過進(jìn)一步增加測(cè)試品種進(jìn)行驗(yàn)證。

［1］王艷青.近年來水稻病蟲害發(fā)生及趨勢(shì)分析 ［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：343-347.

［2］Heinrichs E A,Medrano F G,Rapusas H R.Genetic evaluation for insect resistance in rice［J］.Manila,Philippines:International Rice Research Institute,1985.

［3］葉恭銀，胡萃，舒慶堯，等.轉(zhuǎn)蘇云金桿菌毒蛋白基因水稻抗螟性的離體葉片測(cè)定法［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2000，27（1）：1-6.

［4］姚青，賴?guó)P香，張志濤.水稻抗二化螟特性離體稻株鑒定技術(shù)［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2002，16（4）：385-386.

［5］四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/T1056-2010.水稻抗二化螟性鑒定技術(shù)規(guī)程［S］.

［6］張志濤.水稻品種抗蟲性鑒定技術(shù)概述［J］.國(guó)外農(nóng)學(xué)-水稻，1986 （6）：1-7.

Evaluation of Appraisement Method for Rice Resistance to Striped Stem Borer

LIU Xianbo1,XIE Lihong1,TANG Shaoqing1,TU Jumin2,HU Peisong1,LUO Ju1*
（1China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China；2Zhejiang University,Hangzhou 310000,China；*Corresponding author:luojurice@126.com）

The identification result was consistent with the resistance evaluation to striped stem borer through four different bioassay methods,including detached-leaf bioassay,detached-stem bioassay,stripping detached-stem bioassay and whole plant bioassay.The detached-leaf bioassay is considered as the most rapid and effective method for evaluating resistance ability to striped stem borer.By both detached-leaf and whole plant bioassays,the author identified transgenic rice with Vip3A gene,and further validated the identification effectiveness of the detached-leaf bioassay method.Simultaneously,our preliminary results revealed that detached-leaf bioassay could also perform an accurate identification to rice leaf roller as lepidoptera pests of rice.

rice；striped stem borer；resistance evaluation；technology appraisement

S511；S435.112+1

A

1006-8082（2016）04-0035-04

2016-02-25

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)（2014ZX08001-001，2016ZX08001-001）